我々は、実験のセットアップでルルドデルタArruetaアンテケラ（昆虫学科、オハイオ州立大学/ OARDC、ウースター、オハイオ州）が提供するヘルプを認めます。我々は、EAB幼虫のサンプルを送るための博士テレーズポーランドを（USDA、森林サービス、NRS）感謝。顕微鏡のセットアップが認識されているとDr。ルイスカナスとNuris Mアコスタが提供するのに役立ちます。このプロジェクトの資金は、オハイオ農業研究開発センター、オハイオ州立大学に充当州と連邦資金によって提供されていました。

別のステップで完全なプロトコルは、図1のフローチャートに示されている。解剖を構成する個々のステップは、RNA抽出、ファーストストランドcDNA合成や定量RT - PCRは以下に詳述する。 I.幼虫の解剖<ol><li>この手順の開始時、代わりにエメラルド灰ボーラー、またはEAB、湿ったティッシュペーパーで幼虫の前に解剖が行われるまで。新しく調製した1Xリン酸塩は解剖を通してバッファの寒さを保つために氷の上で、またはPBS、生理食塩水バッファリングしてください。 </li><li>開始するには、微細な解剖ピンと解剖板にEAB幼虫を修正。その後、解剖の板に冷1X PBSを加える。 </li><li>最初に、解剖鋏の罰金ペアで幼虫を斬る。その後、幼虫の最後の腹部のセグメントを削除します。 </li><li>鉗子の時計職人のペアを使用して、幼虫の死骸からキューティクルを持ち上げます。その後、はさみを使用して、枝肉の長さに沿って切開を行います。切開がなされると同時に破裂腸をしないように注意してください。 </li><li>慎重にそのような脂肪体や結合組織などの他の組織から中腸組織を分離する。その後、fatbodyのコンタミネーションがないことを保証するために新鮮な1 × PBS緩衝液中の組織をすすいでください。 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにあらかじめ冷却Trizol試薬を500μLに分離された腸を転送します。 </li><li>次に、鉗子を用いて脂肪体の組織を分離し、チルドTrizol試薬500μLを含む1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li><li>最後に、組織の整合性を傷つけないように注意しながら、任意の付着組織をオフ解体によって幼虫の死骸から表皮組織を分離する。新鮮なPBSバッファーで分離された表皮の組織をリンスし、チルドTrizol試薬500μLを1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li><li>孤立した脂肪体、表皮と中腸組織を-80℃で保存できますRNA抽出までのC。 </li><li> RNA抽出のための準備として、発達段階に応じて様々なEABのサンプルを並べ替える。これらの段階は、1次、2次、第3、および4次齢期、prepupaeと大人が含まれています。 </li></ol> II。 RNA抽出（TRIzol試薬を用いての一人当たりの製造業者のプロトコルとして） 均質化<ol><li> RNAの抽出を開始するには、まずトリゾール含む1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに組織を均質化するプラスチック製乳棒を使用してください。均質化した後、Trizol試薬でそれぞれサンプルTO1 mLの合計量をもたらす。 </li><li>発達段階の場合は、乳鉢と乳棒で液体窒素で全体の動物をホモジナイズする。その後トリゾールの1mLにホモジネートのアリコート（50μg）を追加。 </li></ol>相分離： <ol start="3"><li>室温で15分間1 mLのトリゾールでサンプルチューブをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、各チューブにクロロホルムの200μLを加える。すぐにクロロホルムを加えた後、約15秒間激しく振らない。その後、さらに2〜3分間室温でチューブをインキュベートする。 </li><li>次に、2℃で15分間12,000 xgでサンプルを遠心遠心分離後、RNAは水相になります。水相の体積は600μlの、または、総トリゾール容積の60％にする必要があります。 </li></ol> RNA沈殿<ol start="6"><li>慎重にのみ水相を除去。水相以下の物質の存在は、抽出されたRNAのコンタミネーションの原因となります。その後、適切に標識された1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに水相を移す。 </li><li>水相からRNAを沈殿させ、各チューブにイソプロピルアルコール0.5 mLを混合する。室温で10分間サンプルをインキュベートする。インキュベーション後、2℃で10分間、12,000 xgでチューブを遠心</li></ol> RNAウォッシュ<ol start="8"><li>遠心分離に続いて、チューブから上清を捨てる。 RNAは、チューブの底に形成されたゲル状のペレットに存在しています。トリゾールの1mLあたり75％エタノールの少なくとも1 mLを加え、75％エタノールでペレットを洗浄します。ボルテックスにより混和する。その後、2℃で5分間7500Xgでチューブを遠心</li></ol> RNA溶出<ol start="9"><li>チューブから上清を捨てる。 1分間の小さなテーブルの遠心機で再びチューブを遠心してください。慎重にピペットでチューブから余分な上清を取り除きます。管が開いたままにしておくと5〜10分間ペレットの空気は乾燥させて。これは大幅にその溶解度が低下すると上のペレットを乾燥しないように注意してください。 </li><li>空気乾燥した後、でペレット懸濁します<a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">ジエチル</a> 、またはDEPC処理水を。ペレットを再懸濁するために使用される水の量は、ペレットの大きさに依存します。 SMのためのDEPC処理水50μLを使用大きなペレットのすべてのペレットまたは100μL。ペレットが完全に上下に数回ピペットの先端を移動することによって、DEPC処理水に溶けてみましょう。 </li><li>ペレットが溶解した後、10分間55℃でサンプルを置きます。 </li><li>その後、光度計分光光度計（RNAサンプルを2μL）を使用して、各RNAサンプルの濃度を測定する。 </li><li> -80 RNAサンプルを格納℃でさらに使用するまで。 </li></ol> III。ファーストストランドcDNA合成（Invitrogen社のSuperScriptファーストストランド合成キットを使用してあたりの製造業者のプロトコルとして。） <ol><li>各RNAサンプルについてPCRチューブに以下を追加します。 <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> Xμlを</td></tr><tr><td> 10mMのdNTPミックスM </td><td> 1μlの</td></tr><tr><td>オリゴ（dT）（0.5μg/μLの） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DEPCは水を扱わ</td><td> （8 - x）を添加</td></tr><tr><td> 総量： </td><td> 10μlの </td></tr><tr><td colspan="2">注：xはcDNA合成に使用するRNAの量です。 RNAの濃度に応じて、RNAの2-3μgの各反応に使用され、各反応の合計量は10μlにする必要があります。 </td></tr></tbody></table></li><li> 4分間で65サーマルサイクラーで上記の反応ミックス° Cを置きます。 </li><li> theromocylerからチューブを外して、少なくとも2分間、すぐに氷上に置きます。 </li><li>以下を追加することによって、最初の鎖のマスターミックスを調製する： <table border="0"><tbody><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> 25mMのMgCl 2の </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 0.1M DTT </td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> RNaseの出</td><td> 1μL </td></tr></tbody></table></li><li> 、RNAサンプルを含む各チューブにマスターミックスの9μlを加えペッティングにより混合し、混合物を手短に遠心します。 </li><li>クラーに戻ってチューブをセットし、42℃で2分間インキュベート</li><li>一時停止クラーと各チューブにSuperscript II逆転写酵素酵素（Invitrogen社）を1μl加える。この手順は素早く行う必要があります。 </li><li> 1.5時間42℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 70反応℃で15分間を終了します。 </li><li>クラーからチューブを取り出して、氷の上に置きます。 </li><li>各チューブにRNase H 1μlを加え、37℃でサーマルサイクラーに戻して置きます℃で20分間。 </li><li>クラーからサンプルを取った後、各チューブにヌクレアーゼフリー水20μlを加える。各サンプルの体積は、この段階で倍になります。 </li><li>サンプル2μlを用いて各サンプルの濃度を確認してください。定量RT - PCRで使用するために20ng/μlの濃度を作るために、各試料のアリコートを取る。 20ng/μlの濃度にサンプルを補うために水の量は、合成されたcDNAの初期濃度に依存します。 </li></ol> IV。定量RT - PCR： リファレンス遺伝子のプライマーの設計と測定<ol><li> 60 ° Cと〜100ベーシスポイントの製品サイズの融解温度（Tm）と設計プライマー。 </li><li> AP - PERI1は、この実験の目的の遺伝子として使用されます。リファレンス遺伝子や内部統制は、データの後の分析と正規化のために必要とされる。リボソームタンパク質（AP - RP1）がこの実験のためのリファレンス遺伝子として使用されます。 </li><li>ご参照の遺伝子を含む使用されるプライマーの5uMワーキングストックを準備する。 </li></ol>標準の調製<ol start="4"><li>標準がなされるべき使用されているプラ​​イマーの効率を計算するために。 </li><li>テストされるさまざまなサンプルからのcDNAのミックスをしてください。 </li><li>グラフ内の各目的のポイントの5倍希釈系列を作る。四希釈は十分なはずですが、5を強くお勧めします。 </li><li>ボリュームが使用されているポイント数とどのように多くの技術的複製によって異なります。十分なリファレンス遺伝子を含むテストされる各遺伝子のための標準を作るためにあるはずです。 </li></ol>プレートテンプレート<ol start="8"><li>定量RT - PCRプレートの各ウェルのサンプル名を示すテンプレートを設計します。各遺伝子の基準と少なくとも二つの技術は、サンプルあたりの複製を含めることを忘れないでください。 </li></ol>サイクリングのパラメータを設定する<ol start="9"><li>に定量RT - PCRマシンの電源を入れ、サイクリングパラメータを入力します。次のようにこの実験のためのサイクリングパラメータは、次のとおりです。 ステップ1： <ul><li> 1サイクル：95℃で3分間</li></ul> ステップ2： <ul><li> 40サイクル：95℃15秒、60℃で30秒続く （オプション：融解曲線を決定するためには、次の手順を含む） </li></uL&gt; ステップ3： <ul><li> 1サイクル：95℃1分</li></ul> ステップ4： <ul><li> 1サイクル：55℃1分</li></ul> ステップ5： <ul><li> 81サイクル：55℃30秒</li></ul></li></ol> CFX96（BioRad社）マシン用に設定されたプレート<ol start="11"><li>別のチューブ内の各遺伝子（リファレンス遺伝子を含む）のためのマスターミックスを調製する。各ウェルについて、マスターミックスは、構成されています<table border="0"><tbody><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> 2.5 X SYBRグリーン</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>プライマーリバース</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> 合計ボリューム </td><td> μlの8 </td></tr></tbody></table></li><li>準備中にマスターミックスは、ピペッティングエラーのアカウント1-2余分な反応が含まれています。 </li><li>以前に設計されたテンプレートに従って、各ウェルにcDNAを2μL（20 ng /μLの）追加。その後、反応あたり10μLの合計量で、その結果、各ウェルにマスターミックスの8μLを加える。 </li><li>サンプルがよく混合されていることを確認するまでピペットとダウン（2 - 3X）。液体が先端にとどまるいないことを確認してください。クロスコンタミネーションを避けるために、各サンプルのための新しいヒントを使用してください。 </li><li>プレート全体をセットアップしたら、光学テープでプレートをカバーしています。グリースの存在は読書に影響を与えることができるようにテープに触れないようにしてください。その後、ウェル内のすべての製品は、プレートの底にあることを保証するために1分間500rpmでプレートを遠心する。 </li><li>遠心分離に続いて、プレートの底には氷や水がないことを確認してください。最後に、定量RT - PCRマシンにプレートを配置し、PCRプログラムを実行します。 </li></ol>実験のV.模式図<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：遺伝子発現研究のためのステップの順序を示すフローチャート。 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：中央に中腸を示す）幼虫のEABの解剖。幼虫のEABのB）孤立の中腸<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：）キューティクル（銅）、中腸（MG）と脂肪体（FB）を含むさまざまな幼虫組織におけるperitrophin遺伝子（AP - PERI1）の相対式の値を（回転数）を意味します。 EAB特定のリボソームタンパク質は、（ここに名前、AP - RP1）目的の遺伝子、AP - PERI1ために得られたデータを正規化するための内部コントロールとして使用した。幼虫の組織中のAP - PERI1のB）相対倍に変化。キューティクル組織は、少なくとも発現を示し、したがって、校正器（1X）のサンプル（Pfaffl、2001）とした。 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：）幼虫の齢期（第1、第2、第3および第4）、prepupae（PP）および成人（）を含むEABの異なる発達段階におけるperitrophin遺伝子（AP - PERI1）の相対式の値を（回転数）を意味します。 EAB特定のリボソームタンパク質（AP - RP1）が目的の遺伝子、AP - PERI1ために得られたデータを正規化するための内部コントロールとして使用した。 B）様々な発達段階におけるAP - PERI1の相対倍の変化が。 PPのサンプルは、mRNAレベルの最低水準を示したため、キャリブレーター（1Xサンプル）とした。 VI。結論定量リアルタイムPCR（定量RT - PCR）が異なる昆虫の組織と発達段階にmRNAレベルを診断する有効なツールです。さらに、定量RT - PCRは、主にマイクロアレイと新世代のRNA - seqのようなハイスループット遺伝子発現解析から生成されたデータを検証するために重要なツールとなっています。

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	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

閾値サイクル（Ct値）の値は、定量RT - PCRプレートに各サンプルについて得られる。標準曲線を作成するために、各希釈液について得られたCt値は、その濃度の対数に対してプロットした。実験サンプルのCt値は、この希釈系列の標準曲線にプロットした。目標量は、それぞれの実験、すなわち組織や発生過程での発現用に生成された別々の標準曲線から計算した。相対式の値は、（回転）し?...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

エメラルド灰のボーラー（EAB、<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;）灰の木々の何百万人を殺してエキゾチックな侵襲的な害虫であり、（<em&gt;アオダモ</em北米で&gt;属）。<strong&gt;</strong&gt; EABは、急速に普及し続け、成熟した木々の苗木から、さまざまな年齢の灰の木を攻撃する。しかし、非常にほとんど、あるいはまったく分子知識がEABのために存在する日付に。私たちは、灰の木々の成功した植民地化の援助のEABという組織レベルでの分子ベースの生理学的プロセスを解読することに興味がある。本報告書では、別の幼虫組織における把握するmRNAのレベルまで定量的リアルタイムPCR（定量RT - PCR）（中腸、脂肪体とキューティクルを含む）と1を含むさまざまな発達段階（の効果的な使用方法を示して<sup&gt; ST</sup&gt; - 、2<sup&gt; ND</sup&gt; - 、3<sup&gt; RD</sup&gt; - 、4<sup&gt;目</supEABの&gt; -齢期、prepupaeと大人）。例として、peritrophinの遺伝子（ここに名前、<em&gt; AP - PERI1</em&gt;）は、目的の遺伝子とリボソームタンパク質（のように例示されている<em&gt; AP - RP1</em&gt;）内部統制として。 Peritrophinsは昆虫腸の粘膜であるperitrophic膜/マトリクス（PM）、の重要なコンポーネントです。 PMは、消化と腸上皮への機械的保護を含む多様な機能を備えています。

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

定量リアルタイムPCR（定量RT - PCR）が異なる昆虫の組織と発達段階にmRNAレベルを診断する有効なツールです。このレポートでは、異なる幼虫の組織や侵襲的な昆虫種の発達段階で把握するmRNAのレベルまで定量RT - PCRの使用、エメラルド灰ボーラーを示す。

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

10.6K ビュー.  The Ohio State University. 定量リアルタイムPCR（定量RT - PCR）が異なる昆虫の組織と発達段階にmRNAレベルを診断する有効なツールです。このレポートでは、異なる幼虫の組織や侵襲的な昆虫種の発達段階で把握するmRNAのレベルまで定量RT - PCRの使用、エメラルド灰ボーラーを示す。

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...