RNAiは線虫の遺伝子の機能を明らかにするための有効な方法となり、病原性線虫を効果的に制御する新しい方法として提案されています。RNAiは、線虫をdsRNAに浸すだけで十分であり、手順には十分である。はじめに、Baermann漏斗法によって線虫を集める。
このためには、漏斗の下に固定されたゴムチューブを置き、漏斗の口に2層のろ紙を置きます。ボトリチスシネレア真菌培養物を漏斗に移し、水を加えて真菌マットを浸します。線虫を採取したら、500マイクロリットルの抽出試薬と100マイクロリットルの磁気ビーズを2ミリリットルの遠沈管に加えます。
20マイクロリットルの線虫を吸引し、サンプルを9, 000 x gで30秒間粉砕します。5分間インキュベートし、摂氏4度で10分間12, 000 x gで遠心分離します。上清を新しい遠沈管に移します。
100マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを数回反転させて混合します。3分間インキュベートしてから、摂氏4度で10分間12, 000 x gで遠心分離します。再度、上清を新しい遠沈管に移します。
250マイクロリットルのイソプロピルアルコールを加え、激しく渦巻きます。12, 000 x gで10分間遠心分離し、渦巻きます。上清を廃棄し、500マイクロリットルの75%エタノールを加えてRNAを洗浄します。
サンプルをボルテックスし、続いて摂氏4度で5分間12, 000 x gで遠心分離します。RNAペレットを5分間風乾し、30マイクロリットルのRNase遊離水に再懸濁します。この式を使用してRNA濃度を計算し、A260とA280の比率を計算します。
次に、一対のプライマーを使用して、B.キシロフィルス由来のBX ppm-1遺伝子の部分コード配列を増幅する。次に、ppm-1遺伝子配列をT7プロモーターを含むpGEM-T Easyベクターにクローニングする。クローニングしたプラスミドをPCRの鋳型として使用して894塩基対長ppm-1遺伝子断片を回収する。
次に、in vitro転写キットを使用してdsRNAを合成します。分光光度計を使用してdsRNAの品質を分析し、1%アガロースゲルで生成物を可視化します。4マイクロリットルの5X浸漬バッファーを加え、二重蒸留水で容量を20マイクロリットルに補って、ミリリットルあたり0.8マイクログラムの最終RNA濃度を得ます。
次に、線虫を皿に30分間入れ、卵が底に付着するのを待ちます。卵だけが皿に残るまで、卵を乱さずに水と線虫を慎重に取り除きます。集めた卵を摂氏25度の暗所で24時間孵化し、J2幼虫を得る。
幼虫をチューブに集め、二重蒸留水で3回洗います。次に、幼虫をdsRNA溶液を含むチューブに移します。これに、レゾルシノール溶液を加えて1%溶液を得る。
幼虫へのdsRNAの十分な吸収を確実にするために、幼虫を振とう台に置きます。対照の場合は、dsRNAプローブなしで、またはGFP dsRNAプローブを使用して、同量の線虫を浸漬バッファーに浸します。actBおよびtbb-2遺伝子を内部参照としてqPCRを実行し、遺伝子発現レベルの変化を評価します。
デルタデルタCt法を使用して、溶解曲線とCt値から相対的な遺伝子発現レベルを推定します。RNAi後、J2幼虫をPDAプレート上の灰色かび病の芝生で成虫になるまで培養する。セクション1に示すように、ベアマン漏斗法を使用して大人を収集します。
顕微鏡で成体線虫の画像を取得し、ImageJソフトウェアを使用して、50匹のオスと50匹のメスの線虫の体長を測定します。各サンプルの平均と標準偏差を計算してデータを分析します。スチューデントのt検定を適用して、異なるグループのサンプルの平均を比較します。
RNAi後の相対遺伝子発現解析は、ppm-1 dsRNAがB.Xylophilusのppm-1一遺伝子の発現を効果的に抑制できることを示した。一方、外因性GFP dsRNAはppm-1発現に影響を及ぼさなかった。RNAi後、成人のサイズは性的成熟に達したにもかかわらず著しく減少し、体サイズの小さな突然変異表現型をもたらしました。
変異体の雌と雄の平均体長は、対照群の971および912マイクロメートルと比較して544および526マイクロメートルであり、最も重要なことは、線虫を二本鎖RNA溶液に移し、別の試薬を添加して線虫を刺激して摂食させることである。この方法は大規模な遺伝子スクリーニングに適しており、細胞研究で一般的に使用されています。この方法でB.Xylophilusの遺伝子機能を研究することは、B.Xylophilusの生物学的制御のための指針となる価値があります。
