このプロトコルは、昆虫の草食に応答して植物遺伝子発現を測定するための合理化されたアプローチを使用しています。ペトリ皿で分離された剥離された葉を使用することにより、昆虫は、再現可能な遺伝子発現データに寄与する比較的短い感染期間中に適用および監視することが容易になる。このプロトコルは、多くの植物/昆虫の相互作用に適応することができます。
プラントシステム全体からのベースライン観測が考慮される場合。昆虫の餌付けの予測不可能な性質は困難な場合があります。したがって、適切にステージングされた幼虫と健康な植物の信頼できる供給は、成功の最良のチャンスを提供します。
健康な植物や昆虫がどのように見え、どのように振る舞うべきかを視覚化することは、特に研究分野に新しい研究者にとって最適な結果を達成するのに役立ちます。私と一緒に手順を実証することは、果物や野菜ラボの遺伝的改善の分子生物学者フランシス・ペレスです。節門伝播組織培養ポテト植物を調製するために、まず少なくとも3〜4個の節を有する外植物質から成長したケネベック植物を得る。
滅菌ブレードを使用して、葉を取り除き、葉1本あたり枝組織を約2ミリメートル残します。各節点の上下に約2ミリメートルカットして節幹から節を取り除き、枝を上に向けて節点移動培地を含む滅菌組織培養容器に節線切断を配置します。その後、節点挿片を植物組織培養室に移し、摂氏24度で2〜3週間の成長と16時間の光、8時間の暗い写真期間を行います。
餌を与えるために昆虫を準備するには、M.sextaの所望の幼虫段階を取得し、幼虫の大きさに応じて適切な格納容器の各ウェルに1つの幼虫を移す。ホワイトペーパーが並ぶ6つの適切なサイズのペトリ皿のセットを保持することができる5つの頑丈なトレイを使用して、各収穫時間の配置テンプレートを作成します。各トレイの用紙に適切なサイズのペトリ皿を使用して6つの円のセットをトレースし、1組の円がA、B、Cを制御し、他の出没したA、B、およびC.その後、適切な収穫時間で各配置テンプレートにラベルを付けます。
次に、配置テンプレートの各円に対して1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにラベルを付け、摂動、植物複製レター、収穫時間を適切に特定します。すべてのチューブにラベルが付けられている場合は、テンプレートごとに1つのペトリ皿に滅菌フィルターペーパーディスクを入れ、各皿に余分な液体プールを入れずに滅菌水でディスクを湿らせます。その後、各配置テンプレートの各円に1皿を配置し、各配置テンプレートの横に同じ年齢と相対サイズの3つのジャガイモ植物を配置します。
出没を開始するには、滅菌はさみを使用して各植物から上の2つのサイズの一致した葉を取り除き、コントロールペトリ皿に1枚の葉を入れ、植物ごとに出没したペトリ皿にできるだけ早く置きます。すべての葉が置かれたら、ソフトタッチ鉗子を使用して、少なくとも1匹の幼虫をできるだけ早く各出没皿に移し、目的の出没時間にタイマーを設定します。授乳を観察して、すべての幼虫が食べていることを確認し、必要に応じて非給餌幼虫を置き換えます。
出没時間の終わりにすべての葉から幼虫のすべてを取り除き、収穫のためのタイマーを開始します。各収穫時間の終わりに、各葉を対応するチューブに移し、すぐに液体窒素にチューブを落とし、RNAが単離するまでマイナス80°Cで貯蔵する前に葉サンプルを凍結します。健康な正確にステージングされた幼虫は、葉表面に配置した直後に餌を与え始め、供給は出没期間を通してかなり一貫した方法で継続するべきである。
この葉の底にある幼虫は植物材料を消費せず、失敗した侵入の例です。これらの葉は、2週齢の節電組織培養植物から切り離され、各幼虫段階の異なる速度と摂食様式で消費された。これらの結果に基づいて、第4のインスター幼虫は、より密接に畑栽培ジャガイモ植物のより成熟した土壌栽培ジャガイモ植物の葉への損傷をさらに評価するために選択された。
これらの遺伝子発現研究では、M.sexta草牙に強く反応する2つの新しいC2H2ジンクフィンガー転写因子が、出没アッセイのための剥離葉の使用を支持することを同定した。均一性がより再現性の高いデータをもたらすので、年齢とサイズの一致した葉を使用し、各実験の幼虫を適切にステージングすることを忘れないでください。葉組織は、ストレス誘導反応性酸素種およびジャスモン酸ホルモン誘導体についてアッセイすることができる。
全体のトランスクリプトーム, プロテオーム, またはマイクロバイオーム研究も葉組織に対して行うことができます。.
