マウス小腸陰窩単離のために、単離されたマウス小腸の5ミリメートル×5ミリメートル断片を適切に洗浄して使用する。2ミリモルのEDTAを含むPBS抗生物質で、振とうせずに氷上で30分間インキュベートします。細胞外マトリックス(ECM)の固化を容易にするために、事前に摂氏37度の組織培養インキュベーターで24ウェルプレートをインキュベートします。
組織断片からEDTA溶液を吸引した後、25ミリリットルの新鮮な冷たいPBS抗生物質を加えます。次に、容器を手で30〜40回激しく振ってください。懸濁液を70ミクロンのストレーナーで一度ろ過します。
次のステップに進む前に、顕微鏡下で陰窩の存在を確認してください。次に、懸濁液を390G、摂氏4度で3分間遠心分離します。次いで、クリプトペレットを2%ソルビトールを含む20ミリリットルのDMEM中に再懸濁し、以下、ソルビトールDMEMと呼ぶ。
10ミリリットルのクリプト懸濁液を2つの新しい15ミリリットルチューブのそれぞれに移します。今回は、2本のチューブを80Gの低速で摂氏4度で3分間遠心分離し、細胞または破片から大きな細胞塊を分離します。上清を穏やかに吸引し、各チューブに約2ミリリットルの上清を残します。
次に、各チューブに10ミリリットルのソルビトールDMEMを追加します。懸濁液を再び80G、摂氏4度で3分間遠心分離します。前に示したように上清を吸引し、再懸濁のために10ミリリットルのソルビトールDMEMを追加します。
上清を吸引した後、10ミリリットルの完全なDMEMを加え、上下にピペッティングしてペレットを再懸濁します。浮遊する地下室を効率的に取得するために、サスペンションを1分間休ませます。1分後、両方のチューブからの懸濁液を70ミクロンのセルストレーナーを通して新しいチューブにろ過し、陰窩を精製します。
播種する前に純粋な陰窩を数えるために、3点で6センチメートルの皿に25マイクロリットルの液滴を滴下します。顕微鏡下で4倍の倍率で陰窩の数を数え、25マイクロリットルあたりの陰窩の濃度を計算します。次に、ろ液全体を290Gで摂氏4度で3分間遠心分離します。
シードの場合は、ECM の 40 マイクロリットルあたり 100 個のクリプトの濃度で ECM 内のクリプトを一時停止します。気泡を避けて5〜10回ピペットで上下させ、均質な懸濁液を得ます。次いで、予め加温した24ウェルプレートに1ウェル当たり40マイクロリットルの陰窩懸濁液を播種する。
ECMの重合のために、24ウェルプレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で15分間インキュベートします。マウス上皮成長因子、組換えマウスR-Spondin 1および組換えマウスnogginを含む500マイクロリットルの培養液でウェルあたりECMを覆います。ウェルあたりの材料の最終濃度がここに示されています。
摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートすることにより、陰窩を培養します。ライブイメージングを実行して、タイムラプス画像顕微鏡を使用してオルガノイドの形態形成を最大7日間3時間ごとに記録し、シリアルZスタック画像を取得します。ほとんどすべての孤立した陰窩はすぐに密封され、上皮ニッチから絞り出されると円錐形に見えました。
さらに、最後の画分の陰窩は統合され、培養での使用に適していた。オルガノイド増殖のタイムラプス画像は、腸幹細胞の活発な増殖と分化が出芽を伴う陰窩領域で起こることを明らかにした。出芽は、細胞の移動、増殖、およびパネス細胞分化と結びついていました。
