J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community&#8217;s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).

トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（PEI）の調製<ol><li> H 2 O 100ml中にPEIの約150mgの溶解</li><li>溶液が透明になるまで塩酸を加えてpHを7.4に溶液を調整し、完全に溶解するまで撹拌する。これは、10〜60分を取り、1mg / mlの最終濃度に水を追加してもよい。 </li><li>ときに明確な、5ミリリットルの分量で℃の冷凍庫-80℃で滅菌した0.22μmのフィルターとストアを介してPEI溶液をフィルタリングする。 </li></ol>レンチウイルス粒子の2生産 1日目： <ol><li>細胞株の培養液162 25cm 2フラスコまたは大きなペトリ皿中の60％-80％集密に分割HEK293T細胞（DMEM、10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mMグルタミンサプリメントを補充した）。 </li></ol> 2日目： <ol start="2"><li>一緒に添加することにより、総プラスミドDNAの45μgのを含有するDNAトランスフェクション溶液を準備レンチウイルスパッケージングベクター（pVSVgの7μgの、のpRSVのREV5μgの、PMDLの13μgの）と、興味や関心のあるshRNAの遺伝子をコードするレンチウイルスプラスミド20μgの。 DMEMを用いて、1ミリリットルの容積に調整します。 </li><li> DMEMの930μlに1 mg / mlのPEIの90μLを添加することにより、PEIのトランスフェクション溶液を調製し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> PEI溶液へのDNAのトランスフェクション溶液を加える。ボルテックスまたは回数を反転し、DNAトランスフェクション溶液を得るために、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> HEK293T細胞へのDNAのトランスフェクション溶液2mlを滴下すると、37℃で加湿細胞培養インキュベーター中で4時間インキュベートする。 </li><li> 4時間後、PEIを除去して、培地をリフレッシュ。これは、新たな培地を添加する前に細胞を洗浄する必要はない。 注：PEIは4時間よりも長く細胞毒性およびインキュベーション時間はHEK293T細胞に害を引き起こす可能性がある。 </li></ol> 4日目： <ol start="7"><li> Supeのを交換してください新しい培地でrnatant。上清（ウイルスを含む）を保持する。これは、ステップ2.10において使用される。 </li><li> 15ミリリットルのフラスコに上清を入れてください。死細胞、500×gで5分間遠心分離を削除するには。 </li><li>大60ミリリットル注射器を用いて0.45μmのフィルターで上清を押してください。 4℃で一晩保管してください。 </li></ol> 5日目： <ol start="10"><li>上澄みの第二のバッチを収集。ステップ2.8から2.9のように遠心分離し、フィルター。 </li><li> 90分間超遠心機50,000×gでのステップ2.9と超遠心管中で2.10と遠心機からの上清をプール。 </li><li>非常に慎重に超遠心管を含むカプセルを取り出し、遠心内側チューブの向きを覚えて、層流フードに入れた。 </li><li>ペレットは、チューブの上側になるような方法で慎重に超遠心管とデカント媒体を保持開放カプセル。ウイルスのペレットが視覚化するのが難しい場合がありますので、何に覚えているチューブの側面は、ペレットを形成しているでしょう。マイクロピペットを取り、超遠心分離管の底部の側に表示されている不透明な茶色のペレットを攪拌しないように注意しながら、媒体の最後のビットを削除する。 </li><li> 10 mMのニコチンアミド、10μMCHIR99021、10μMのY27632及び8 / mlのポリブレンを補足したオルガノイド培養液500μlにこのペレットを再懸濁。高力価ウイルスを直接オルガノイドをtransductするために使用されるので、この培地中で再懸濁することが重要である。 </li><li>オプション：-80℃における250μLの2回に分けて等分し、この中でウイルスを凍結する。 </li></ol>オルガノイド3.レンチウイルス形質導入 0日目： <ol><li>約50の小さなオルガノイドを得ることを目指し、新たな井戸に形質導入2日前オルガノイドのフル0.95センチメートル2うまく分割します。以前に公開されたプロトコル1（ 図3A、B）に応じてオルガノイド分割します。 </li><li>嚢胞ハイパー増殖陰窩（ 図3C）を取得するために、10μMCHIR99021および10 mMのニコチンアミドを含む培養培地をオルガノイドサプリメント。 注：たてスプリットオルガノイドはCHIR99021の存在下で増殖させた場合嚢胞性陰窩は、最高の開発します。 </li></ol> 2日目： <ol start="3"><li>それによってP1000マイクロピペットとの混合物を破壊し、ピとマトリゲルとメディアダウンによる収穫オルガノイド。 15ミリリットルチューブに混合物を配置します。 </li><li>遠位開口部を溶融することにより減少されたパスツールピペットを用いてさらに混乱させる。遠心分離機は、100×gで5分間ペレット化しオルガノイド。 注：遠心機の大きさに依存は、異なる遠心分離速度を使用しています。これは、破壊されたオルガノイドを混合物から分離された正確な速度を求める必要がある。 </li><li>上清を除去し、予め温めておいた500μlのを追加する1×トリプシン（0.25％トリプシンに似ています）。トリプシンでオルガノイドを再懸濁し、インキュベート37℃の水浴中で3分間。 </li><li>細胞株の培養培地中の3.5を加えてトリプシンを不活性化（DMEM、10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよびグルタミンを補充した）。 500×gで5分間遠心。 </li><li>メディアの約20μlのペレットを残して上清を取り除きます。 48ウェルプレート上のウェルに培地のこの最後の少量オルガノイドを転送します。 </li><li>ステップ2.14で説明したように、伝達媒体中の高力価レンチウイルスを追加し再懸濁し、3.10に進みます。低い形質導入効率に遭遇した場合は、ステップ3.9を添加してもよい。 注：効率的な形質導入のために、典型的オルガノイドの1ウェルに高力価レンチウイルス250μlのの1アリコートを追加します。このプロトコールのステップ2に記載したように、これは、単一の生産からのすべての収穫レンチウイルスの50％を占める。 </li><li>オプション：32に予め温め遠心機でオルガノイドを含む48ウェルプレートを置くことによってピノキュレーションを行い、形質導入効率を向上させるために6; C、1時間、600×gで回転させる。 </li><li>培養インキュベーター中オルガノイド、ウイルス混合物を入れて形質導入を可能にするために培養インキュベーター中、37℃で1時間インキュベートする。 </li><li>オプション：さらに培養インキュベーター中、37℃でさらに3時間インキュベートオルガノイドを、形質導入効率を向上させることができる。 </li><li>オルガノイド培養液の1ミリリットルを追加し、オルガノイドウイルス混合物を再懸濁し、オルガノイドをペレットに850×gで5分間微量マイクロ遠心チューブと遠心分離機に移す。 </li><li>上清を除去し、氷冷マトリゲル20μlのペレットを再懸濁。それは暖かくなったときに材料が固化するので、回数のために冷PBSアップピペットで氷下で冷却されたピペットチップを使用しています。 </li><li> 48ウェルプレートにウェルの中央に小滴を入れて、固化し、15分間37℃で培養インキュベーター中でインキュベートする。 </li><li> 15分後、慎重に補充したオルガノイド培養培地250μlを添加する10 mMのニコチンアミド、10μMCHIR99021および10μMY27632。小型破砕オルガノイドの断片は24時間以内に小さな嚢胞オルガノイドに形成することになる。 </li></ol> 5日目： <ol start="16"><li>メディア更新し、選択抗生物質で補う（ピューロのために、4 / mlのを使用します）。 </li></ol> 7日目： <ol start="17"><li>選択抗生物質を補充した標準オルガノイド培養液、ための媒体を交換してください。 注：出芽は2~3週間CHIR99021の撤退後に完了します。選択後、オルガノイド、選択抗生物質なしに成長させることができる。 </li></ol>定量的RT-PCRまたはマイクロアレイ4.オルガノイドRNAの準備<ol><li> RNA調製のために、製造者のプロトコールに従って市販のキットを使用する。オルガノイドから培地を除去し、バッファRLT350μlのを追加し、ストレートオルガノイドを含むマトリゲルのドームにβメルカプトエタノールを補充した。 materiを再懸濁P1000のマイクロピペットを用いてピペッティングすることによりRLTでアル。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、さらにRNAの準備を行います。 </li><li>オプション：製造業者のプロトコールに従って50μgの総RNAの初期入力を必要とする、オベーションピコWTAシステムを使用して増幅することによってRNAの収量を増加させる。 </li><li>オプション：RNAマイクロアレイの前に、品質管理のために、製造業者のプロトコールに従って8.5以上（ 図5）のRNA完全性番号（RIN）を目指して、真核生物全RNAナノチップを使用して2100バイオアナライザー上で実行したサンプル。 </li></ol>パラフィン包埋し、免疫組織化学5.処理オルガノイド<ol><li>パラフィン、液体を保持する穴に前加温アルミニウムブロックを70℃のインキュベーター中に嵌合する直径12mmのガラス管を埋め込むオルガノイドの開始前。 </li><li>そのまま埋め込まれたオルガノイドを残して、完全に成長したオルガノイドで単一のウェルを取り、培地を除去。 </li><li> 1ミリリットルを追加PBS中の4％パラホルムアルデヒドのストレートによく、どこでも1時間一晩に4℃で固定してください。 </li><li>氷冷PBS 1mlのホルムアルデヒドを交換してください。 オプション：このステップの後、4℃で1週間までのPBSで固定オルガノイドを保つ。 </li><li> 1mlのPBSで固定オルガノイドを再懸濁し、ガラスバイアルに入れる。 </li><li>オルガノイドは、1分間の底に沈むPBSをデカントし、エオシン溶液の液滴のカップルが埋め込みプロセスを通してオルガノイドの可視化を可能にするために溶解した70％エタノールで代わっ。 </li><li>室温で70％エタノールでオルガノイドのままにしておきます。 30分後、慎重にあるため若干のピンクがかったエオシン色の目でオルガノイドを視覚化することができるという、デカンテーションによって70％のエタノールを除去。 96％エタノールに埋め込むソリューションを交換してください。 </li><li>手順を繰り返し5.7、次の1と埋め込みソリューションを交換するたびに。続いて、次のソリューションを通じてオルガノイドを渡す：70％エタノール、90％エタノール、96％エタノール、100％ETHAをタノール、100％エタノール、キシレン、キシレン。 </li><li>最後のキシレン洗浄をデカントし、チューブにパラフィンを注ぐ。 30分間、70℃でアルミブロックを温め前にすぐにチューブを入れて、新しいクリーンなパラフィンでパラフィンを交換してください。 </li><li>大きな開口部を予め温めパスツールピペットを用いて、パラフィンブロックの型にオフパラフィン及びピペットオルガノイドを注ぐ。ブンゼンバーナーを使用して、パスツールピペットを暖かく保つ。流動パラフィンの小さな層にパラフィンブロック金型内のすべてのオルガノイドを置きます。 </li><li>できる限り、温め解剖針を用いてパラフィンブロック金型の中心に向かってすべてのオルガノイドを操作してみてください。ブンゼンバーナーを使用して、解剖針を暖かく保つ。 </li><li>鋳型内のオルガノイドの局在化​​が良好である場合に、パラフィン層を固化するためにわずかに金型を冷却する。 </li><li>上に多くのパラフィンを注ぐことにより、ブロックを終了し、標準的な組織学的埋め込みカセットを追加します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+epidermal+growth+factor+(EGF)+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents.">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin1,+a+novel+intestinotrophic+mitogen,+ameliorates+experimental+colitis+in+mice.">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids.">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis.">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li><li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer.">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

現在のビデオプロトコルは、プライマリ腸上皮からオルガノイドのレンチウイルス形質導入および定量的RNA技術と免疫組織化学を使用して、これらのオルガノイドの下流の分析を記載する。 レンチウイルス形質導入は、多くの場合、培養プレート中の付着または浮遊細胞で行われる。オルガノイドの三次元構造は、ウイルス粒子に浸透し、それらを困難にするので、有?...

腸上皮は、それが癌や幹細胞の研究から幅広い関心を引き付けるために引き起こした最も急速に増殖する身体組織の一つである。 2009年には技術が3次元構造1を保全、マトリゲルに小腸陰窩の長期的な文化を生成するために出版された。これらの構造は、腸のオルガノイドと呼ばBMPのシグナル伝達経路阻害剤のノギン（ノグ）を含む定義された成長因子の数は、1（Rspo1）をrspondinはWntシグナル伝達経路の増強剤を補充した周囲の媒体との、標準的な技術を用いて培養することができ上皮成長因子（EGF）は、すべての腸の増殖2-4を増強することが見出さ。 オルガノイドは、それらが非変異している点で、伝統的な癌細胞株を上回る幹細胞の階層構造を維持している、発生期の小さなint型で見つかったすべての細胞系統にそのまま携帯分極、展示分化を表示estinal上皮。これらは導入遺伝子を担持するように形質導入され得るか、またはRNA干渉は5構築ので、コストと速度のファセットトランスジェニックマウスを用いた実験を上回るため、特定の遺伝的要素を研究するために使用される。オルガノイドにおけるトランスジェニック発現は、マウスレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは6,7のいずれかを用いて行うことができる。による有糸分裂細胞もっぱら8を形質導入することが可能なマウスレトロウイルスの制限のため、レンチウイルス形質導入は、より頻繁にオルガノイドのように感染することが困難である細胞のために使用される。 ウイルス形質導入および安定的に発現するトランスジェニックオルガノイド分析および免疫組織化学、定量的RNAを含む、下流の分析の多数のために使用することができる。総合すると、主要な腸上皮細胞からオルガノイドの文化は、特定の実験室の要件なしに実装するのは簡単ですルーチン技術へと進化してきました、およびCEにおける新規標準となっている腸上皮の研究におけるLL文化。 オルガノイドでのウイルス形質導入およびその後の下流の分析の技術は、実行することが、我々は、培養オルガノイドのレンチウイルス形質導入のための方法を示し、このビデオプロトコルを生成したオルガノイド実験を支援するために面倒である。我々はさらに、収率を増加させるので、RNA技術または免疫組織化学を用いて、下流の分析の性能を向上させることができる方法を正しい処理オルガノイドを示す。説明される技術は、同様に、結腸オルガノイドに適用することができるが、プロトコルでは、小腸の陰窩から誘導されるオルガノイドが独占的に使用された。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Reagent</td>
			<td style="width:91px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Cat. No.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Polyethylene imine</td>
			<td style="width:91px;">polysciences</td>
			<td style="width:103px;">23966-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:91px;">Lonza</td>
			<td style="width:103px;">BE12-614F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:91px;">Lonza</td>
			<td style="width:103px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Glutamin</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">25030-024</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">matrigel</td>
			<td style="width:91px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">BD 356231</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Advanced DMEM-F12</td>
			<td style="width:91px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">N2</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">B27</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-1G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Egf</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8045</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glutamax 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-038</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir 99021</td>
			<td>axon</td>
			<td>1386</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107689</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-007E</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">puromycin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P 7255</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8,057,400,250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ovation Pico WTA system</td>
			<td>NuGen</td>
			<td>3300-12</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass vial conical 12mm x 75mm 5ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LSUKM12</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin Yellowish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,159,350,025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

オルガノイドレンチウイルス形質導入 レンチウイルス粒子を使用したオルガノイド形質導入の技術は前と形質導入時のオルガノイドの正しい取り扱いに依存します。オルガノイド（ 図3A）を培養し、それらは単一の陰窩（ 図3B）に破砕した。既報の通り、GSK3阻害剤CHIR99021の存在下で培養されたこれらの単一陰窩は、嚢胞性陰窩9（</sup...

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A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.4K ビュー.  Academical Medical Center. In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. 

ビデオ: A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

タンパク質のユビキチン化の検出

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

画像解析のためのクロックスキャンプロトコル：ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

マウスへのレーザ レンチ ウイルス遺伝子導入受精卵

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is compartmentalized into crypts and villi: the stem and proliferating cells are confined to the crypts, whereas the villi epithelium contains only differentiated cells. Hence, the normal intestinal crypts, but not the villi, can give rise to organoids in 3D cultures. The procedure described here is applicable only to villus epithelium undergoing dedifferentiation leading to stemness. The method described uses the Smad4-loss-of-function:&#946;-catenin gain-of-function (Smad4KO:&#946;-cateninGOF) conditional mutant mouse. The mutation causes the intestinal villi to dedifferentiate and generate stem cells in the villi. Intestinal villi undergoing dedifferentiation are scraped off the intestine using glass slides, placed in a 70 &#181;m strainer and washed several times to filter out any loose cells or crypts prior to plating in BME-R1 matrix to determine their organoid-forming potential. Two main criteria were used to ensure that the resulting organoids were developed from the dedifferentiating villus compartment and not from the crypts: 1) microscopically evaluating&#160;the isolated villi to ensure absence of any tethered crypts, both before and after plating in the 3D matrix, and 2) monitoring the time course of organoid development from the villi. Organoid initiation from the villi occurs only two to five days after plating and appears irregularly shaped, whereas the crypt-derived organoids from the same intestinal epithelium are apparent within sixteen hours of plating and appear spherical. The limitation of the method, however, is that the number of organoids formed, and the time required for organoid initiation from the villi vary depending on the degree of dedifferentiation. Hence, depending upon the specificity of the mutation or the insult causing the dedifferentiation, the optimal stage at which villi can be harvested to assay their organoid forming potential, must be determined empirically.

The procedure describes isolation of the villi from the mouse intestinal epithelium undergoing dedifferentiation to determine their organoid forming potential.

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

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神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

タンパク質のユビキチン化の検出

4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

画像解析のためのクロックスキャンプロトコル：ImageJ Plugins

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

マウスへのレーザレンチウイルス遺伝子導入受精卵

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

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神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

タンパク質のユビキチン化の検出

4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

画像解析のためのクロックスキャンプロトコル：ImageJ Plugins

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

マウスへのレーザ レンチ ウイルス遺伝子導入受精卵

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

マウスへのレーザレンチウイルス遺伝子導入受精卵