肝臓は哺乳類の中で最大の器官です。代謝と解毒において非常に重要な役割を果たしています。.肝臓は、インビトロで顕著な再生能力を持っていますが、それはまだ肝細胞のインビトロを培養するために長期的には非常に大きな課題です。
ここでは、成熟した肝細胞から肝細胞オルガノイドを確立する。これは、形態と機能における肝細胞の主な特徴を保持します。本ビデオでは、これらのオルガノイドの培養と通過の仕方と、これらのオルガノイドの遺伝子改変を詳細に行う方法について紹介します。
まず、肝臓灌流と消化。すべての領域と器具を準備し、それらを無菌にします。マウスを洗って表皮と皮膚を開き、肝臓のポーチオーブンを見つけようとします。
それに針を注入し、これをキャプチャします。肝臓が青白くなるまで、毎分5ミリリットルの速度で灌流を行います。灌流バッファーにそれらを変更, 慎重に置きます, 肝臓を見て, それが柔らかくなるまで.
通常、それは3〜5分かかります, その後、肝臓をカットし、プレートに入れて、ハサミで小片にカット.頻繁にそれを上下にペップ。通常、単一の細胞にそれらを作るために10〜15分かかります。
そして、10〜15分でそれを上下にペップし、フィッターを通してそれらを供給します。それらを単一のセルにします。50ミリリットルチューブ内のすべての細胞を収集し、速度で遠心分離し、プレートごとにすべての収集します。
常に冷たい氷の中でそれらを維持してみてください。単一セルの懸濁液を作り、セルカウンターでそれらを数えます。通常、肝細胞は幸せであれば、生き生きとした蛍光を有する。
第二に、細胞を座ってオルガノイド培養を行います。我々は、すべての細胞の懸濁液を収集し、特定の点心融合を有する細胞を数え、その後、混合する。メトロゲルス。およびコードメディア。
通常、我々は、媒体とメトロゲルで、1〜2または1〜3の比率で取る。慎重に混合した後、グラデーションプレートに座ります。我々は通常、24プレートウェルで100マイクロリットルを追加します。
37度の温度でインキュベーターに入れます。20分後、下の下を逆にして、メディアに戻します。2、3日のカウンターで、私たちは通常、オルガノイドが出てくるのを見ます。
これは私たちのオルガノイドの典型的なイメージです。我々は通常、我々は通路を行うか、いくつかの遺伝子組み換え方法を行う場合は、オルガノイドからの単一の細胞が必要な我々はコート洗浄緩衝液とカウンタープレートからすべてのオルガノイドを収集します。上清を落とし、コートウォッシュバッファでプレートに入れ、それらを混ぜるので、それを上下にペップします。
そして、我々は通常、洗浄テープバッファですべての先端を事前に洗浄します。すべてのオルガノイドの先端を避けるために、そして、氷の上またはそれなしで新しいバッチで、我々はセントロフュージョンによってすべてのオルガノイドを収集します。
私たちはそれらを扱う、すべてのメトロゲルを削除するための説得力のある放射があります。氷上でのインキュベーションの20〜30分後にすべてのメトロゲルが除去されます。私たちは、すべてのきれいなオルガノイドを収集し、単一の細胞にそれらを作るためにトリプシンを追加します。
トリプシンを添加した後、オルガノイドをインキュベーターに取り入れ.肝オルガノイドが単一細胞になるには5~10分かかります。我々は、三Latinを停止するために、より多くの洗浄バッファーを追加します。
そして、彼らに向かって上下にそれをペップ。オプションプロセスの場合は、もう一度洗ってすべてのトリプシンを取り除くことができます。セントロフュージョンで洗浄した後、細胞カウンターの下で数えることができます。
次に、これらの肝細胞オルガノイドのトランザクションまたはトランスフェクションを行う方法を示します。まず、あなたが何をするかのチューブにラベルを付け、次にメーカーの指示に従って視力トランスフェクションを行います。あなたは必要です, INI MaXを飼いならすリポイル事実の摂政.
を追加します。コントロールと特定の遺伝子siRNA、およびメーカーの指示に従って、最適でそれらをインキュベートします。そして、細胞濃度に応じて、RAN Maxを追加し、それらを徹底的に混合します。
その後、我々はまた、別々に最適でRANの最大値を追加し、氷の上に置きます。5分後、我々は別のsiRNA、特異的遺伝子RANiおよびII対照を別々に別々に別々のRAN最大混合物をペップアップし、それらを徹底的に混合する。再び氷の上に置き、その後、我々はすべてのオルガノイド、遅い中心注入を収集し、すべての上清をドロップし、我々はこの細胞プレートにRNAi max、siRNA混合物を追加し、徹底的にそれをペップ。
簡単に言えば、細胞とRNAi maxおよびsiRNA混合物の標識を、37度で4〜5時間の間、ジェントリフィケーションとインキュベートした。最後の部分, これらの肝細胞オルガノイドもレンチウイルスに感染する可能性があります。.同様のメッセージをsiRNAトランスフェクションとして行った。
コントロールとsiRNAウイルスチューブは十分に準備され、そして最適はメーカーの指示に従って加えられた。その後、ポリグリーンのような感染領域で、我々はメーカーの指示の憲法に従って、異なるレンティウイルスを追加します。オルガノイド培養物と1.5ミリリットルのエペンドルフチューブの様々な粒子で単一細胞懸濁液を組み合わせ、よく、それらを混ぜて、この混合物をプレートし、32度で1時間濃縮します。
濃縮融合は500 G.で行われ、37度で4〜5時間のインキュベーションの後、細胞懸濁液を回収し、メトロゲルに着席する。そして、再び保育器にそれらを入れてください。形成効率または他の機能解析に関する器官は、7〜10日後に行われ得る。
ここに私たちの代表的な結果があります。図1Aでは、マウスからALB-クレローザ26-GFPまたはRFP肝細胞オルガノイドを見ることができました。図1Bでは、染色におけるKi67陽性シグナルが見え、肝細胞オルガノイドが増殖していることを示しています。
図2Aと2Bは、私たちの遺伝子の干渉発現の代表的な遺伝子発現です。肝細胞オルガノイドの遺伝子操作後、干渉効果は非常に効率的である。図2Cは、私たちのマウスオルガノイドのコネリット技術で遺伝子操作した後に見ることができます。
結論として、我々の結果は、肝細胞オルガノイドが体外で拡大され、遺伝的に操作できることを示した。要約すると,このビデオでは肝細胞を得るために肝臓灌流と消化を行う方法を示します。肝細胞を捕獲し、肝細胞オルガノイドを通過する方法.
また、これらのオルガノイドの遺伝子の改変を行うsiRNAおよびベクタートランスフェクションまたはレンチウイルス感染を行う方法を示した。また、オルガノイドには2つの不足があります。まず、肝細胞を純粋にするためにコア当たりまたは毛皮コアを使用しませんでした。
そして第二に、私はより多くの成長因子とシグナリングが成長するオルガノイドの時間を改善しようとするべきだと思います。
