オルガノイドとスフェロイドは非常に壊れやすいため、取り扱い中に深刻な損傷を受けます。当社のプロトコルは、これらの3D成長構造がさまざまなプロセスで無傷のままであることを保証するため、精度、再現性、信頼性、再現性が向上します。研究者は、オルガノイドとスフェロイド全体をさまざまな顕微鏡で培養、凍結、解凍、処理、染色、標識、および検査することができますが、それらは単一の多目的デバイス内のヒドロゲルにそのまま残ります。
これにより、疾患モデルの作成と1つの多目的デバイスでの連続ステップの追跡が可能になります。この技術は、病気の診断と予後のためのバイオマーカーを調べる際に、より精度を高めます。この方法は、オルガノイド、スフェロイド、個々の細胞、または生物を含む任意の3D成長システムに適用できます。
オルガノイドまたはスフェロイド培養を開始するには、適切に解凍したヒドロゲルを層流フード内の氷上に15分間置きます。また、肝細胞癌またはHEPG2細胞のペレットを含むチューブを氷上に保管してください。次に、予め温めた多目的装置のニッチ内に30〜35マイクロリットルの100%ヒドロゲルをプレートしてゲルドロップを作成し、ヒドロゲルドロップの上部の中央に10, 000個のHEPG2セルを配置し、セットアップを摂氏37度で15分間インキュベートします。
インキュベーション後、ヒドロゲルドロップを10%ウシ胎児血清(FBS)を含む200マイクロリットルのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で覆います。インキュベーターに入れる前に、ガスの流れを許して、装置に蓋を適切に置きます。一日おきに、10%FBSを含む200マイクロリットルのDMEMを細胞に与えます。
倒立顕微鏡でスフェロイドの成長を確認します。オルガノイドの免疫蛍光標識を開始する前に、必要な培地と溶液を摂氏37度に温めます。ヒドロゲルドロップを囲む細胞培養培地を吸引してから、摂氏37度に予熱した4%パラホルムアルデヒド200マイクロリットルを加え、摂氏37度のインキュベーターに15〜30分間入れて固定します。
次に、固定液を吸引し、免疫蛍光標識(SIF)用の溶液を、摂氏37度に予め加温した溶液をそれぞれ10分間3回洗浄します。次の手順に進む前に、ニッチの周囲の領域に蒸留水を追加して湿度を提供します。ヒドロゲルドロップを囲むSIFを吸引し、SIF中の100マイクロリットルの予備加熱一次抗体溶液をヒドロゲルに加えてから、摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。
その後、一次抗体溶液を吸引し、摂氏37度に予め加温したSIFでそれぞれ10分間3回洗浄する。洗浄後、残りのSIFを吸引し、SIF中の予め温めた二次抗体溶液100マイクロリットルをヒドロゲルに加える。ヒドロゲルを摂氏37度で暗所で30〜60分間インキュベートします。
インキュベーション後、二次抗体溶液を吸引し、ヒドロゲルドロップを摂氏37度のPBSで3回暗所でそれぞれ10分間洗浄します。次に、残留PBSを吸引し、含入媒体またはグリセロールを含む100マイクロリットルの核DNA染色剤とともにヒドロゲルを摂氏37度の暗所でインキュベートします。ヒドロゲルを含む多目的デバイスをしっかりと閉じる前に、乾燥を避けるためにニッチをグリセロールで満たします。
共焦点顕微鏡でオルガノイドを調べるには、原稿の指示に従って顕微鏡パラメータを設定します。オルガノイドを凍結するには、細胞培養培地を吸引し、予め温めた凍結溶液を200マイクロリットル加え、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。フォームボックスに入れる前に、デバイスの蓋をしっかりと閉めてください。
このフォームボックスを別のフォームボックスに入れ、両方のフォームボックスをしっかりと閉じます。箱を摂氏マイナス20度で2時間保ち、マイナス80°Cの冷凍庫に一晩置きます。オルガノイドを6ヶ月以上保管するには、オルガノイドが入っている多目的装置を箱から取り出し、液体窒素タンクに移します。
オルガノイドを解凍するには、冷凍庫または液体窒素タンクからサンプルを含む多目的デバイスを取り出し、摂氏37度のインキュベーターに直接入れます。解凍したら、培地と凍結溶液の混合物を穏やかに吸引してから、新しい培地を添加し、ホールマウントオルガノイドヒドロゲルのイメージングに進みます。ライブイメージングでは、ヒドロゲル内の成長しているオルガノイドは、細胞ペレットを挿入してから3〜5日後に、特にヒドロゲルドームの周辺で見えるようになりました。
倒立位相差顕微鏡下でのスフェロイドを含むヒドロゲルのさまざまなレベルでの時系列画像がここに示されています。細胞膜と核を生染色した後のホールマウントリビングオルガノイドの共焦点顕微鏡画像は、周辺と中央で同様の標識密度を示しました。さらに、ホールマウントステロイドの免疫蛍光標識は、1つの抗体、2つの抗体、および3つの抗体で正常に実行でき、追加の治療ステップが不要になりました。
代表的な分析は、デバイス内の2つの免疫蛍光標識気道オルガノイドを示しています。多目的デバイスにおけるスフェロイド全体のSEM画像および切片化されたステロイドの10枚の画像は、スフェロイド、細胞質オルガネラ、および他の超構造細胞の特徴のよく保存された3D構造を示し、記載されたプロトコルの有効性を実証した。ヒドロゲルドームの境界における不規則性は、サンプルを凍結した後に明らかであった。
しかしながら、回転楕円体のサイズおよび真円度は類似したままであった。凍結試料を解凍した後に培養表面上の細胞移動を観察した。テクニックはとても簡単です。
ただし、研究者は、サンプルの損傷を防ぐために、ヒドロゲルドロップの周囲の液体を吸引または追加するときは、非常に穏やかである必要があります。研究者は、ハイテク顕微鏡を使用して単一のデバイスで同じサンプルを見て、相関研究を行うことができます。
