Mitochondrial Isolation for Transmitochondrial Cybrid Generation

7日目に約2500万個のミトコンドリアドナー細胞が得られたら、指数関数的に増殖した細胞を50ミリリットルのチューブで回収し、室温と520gで5分間遠心分離して収集します。細胞を冷たいリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、室温で520gで5分間遠心分離して沈降させます。次に、冷たい試薬を使用して摂氏4度でミトコンドリア全体の抽出を実行し、細胞またはミトコンドリアを氷上に保ちます。

3回目の遠心分離後、真空ポンプに結合したガラスピペットを用いた吸引により上清を廃棄し、細胞ペレット容量の7倍に等しい低張緩衝液容量に充填細胞を再懸濁する。次に、細胞懸濁液をホモジナイザーチューブに移し、氷上で2分間インキュベートして細胞を膨潤させます。毎分600回転で回転するモーター駆動の乳棒に結合されたホモジナイザーで8〜10ストロークを実行して、細胞膜を破壊します。

細胞ホモジネートに、初期ペレットの体積の7倍に等しい低張バッファーを添加して、等張環境を生成します。ホモジネートを15ミリリットルのチューブに移し、固定ローターで1, 000g、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清の3/4のみを収集し、ペレットから大きなマージンを残して、核または無傷の細胞による汚染を回避し、別のチューブに移します。

このプロセスを2回繰り返した後、ミトコンドリア画分を含む上清を1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブを最高速度 18 、 000 g で 4 °C で 2 分間遠心分離します。上清を捨て、ミトコンドリアが豊富なペレットをバッファーAで洗浄し、2つのチューブの内容物を1つにまとめ、前述のように遠心分離します。

すべての材料が1本のチューブだけに入るまで、このプロセスを繰り返します。最後の遠心分離から得られたペレットを300マイクロリットルのバッファーA.Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。ミトコンドリアレシピエント細胞株との融合前に、核タンパク質の免疫検出によりミトコンドリア画分中の核夾雑物の不在を評価する。

あるいは核遺伝子の定量的ポリメラーゼ連鎖反応またはQPCR増幅を行う。