ゼブラフィッシュにミオメア凍結損傷を行うには、カスタム製造されたステンレス鋼クライオプローブを使用してください。手順中のプローブの取り扱い中に凍傷を避けるために、プローブハンドルをピペットチップに挿入し、テープで包んで固定します。凍結損傷手順を開始する前に、麻酔作業溶液用のビーカー、魚を取り扱うためのスプーン、湿ったスポンジ、および手順後の魚の回収のためのシステム水の入ったタンクを準備します。
画面に表示される手順に従って麻酔原液を調製します。次に、ビーカー内の100ミリリットルのシステム水に4ミリリットルの調製原液を加えて、トリカイン作業溶液を調製します。凍結損傷手順を開始するには、プローブを液体窒素に最低3分間浸します。
スポンジをシステム水で濡らし、平らな面に置きます。次に、1匹の成体ゼブラフィッシュをトリカイン作業溶液に移してから1〜2分後に、スプーンで魚にそっと触れて、その無反応を確認します。麻酔をかけた魚を濡れたスポンジの上に置きます。
尾柄を臀鰭の後方、尾鰭の前に配置します。この段階で、液体窒素からクライオプローブを取り外します。プローブを軽く振って、先端に液体窒素が残っていないことを確認します。
へらの端を体に垂直に尾柄に置きます。クライオプローブを組織から解放する前に、圧力をかけずにプローブをこの位置に6秒間保ちます。次に、魚を回収タンク内のシステム水に移します。
麻酔から目覚めた後、呼吸と水泳を再開する間、魚を監視します。30秒経っても手術運動が起こらない場合は、動物が自分で呼吸を開始するまで、システムの水をえらにピペッティングして魚を刺激します。傷害またはDPCIの翌日の対照魚と凍結損傷魚のビデオ録画により、凍結損傷した魚の泳ぎはそれほど活発ではありませんでしたが、渦巻き、畳み込み、平衡の低下などの異常な動きは見られませんでした。
畜産システムでは、タンク内の位置と食物摂取量は、無傷の魚の位置と同様でした。5 DPCIで観察されたように、通常の行動は依然として持続的であり、凍結損傷手順が動物の健康に深刻な影響を与えなかったことを示しています。
