ゼブラフィッシュは、脊髄損傷から回復する能力のために貴重な神経再生モデルを提供します。この方法は、機能的な脊髄修復の読み出しとして水泳持久力および水泳行動を記述する。この技術は、成体ゼブラフィッシュの水泳持久力および水泳行動の信頼性および定量化可能な評価を提供する。
これらの方法は、神経筋および筋骨格系の発達、疾患、および再生の研究にも同様に適用可能である。スイム耐久性を評価するには、流速制御ソフトウェアを開きます。[実験] というラベルの付いたボックスをクリックし、[Uswim と Uwater] のチェックを外します。
次に、左下のUwaterボックスで流速を変更して、水流速度を調整します。自動プロトコルを開始するには、[ログ記録の開始] ボックスをクリックします。開いたダイアログウィンドウで、ドロップダウンリストから「自動」を選択します。
以前に保存したプロトコルファイルを開くには、プロトコルファイルの横にあるファイルアイコンをクリックします。次に、ログファイルの横にあるファイルアイコンをクリックして、出力ファイルを設定します。開いたファイルエクスプローラウィンドウで、出力ファイルに名前を付け、目的の場所に保存します。
次に、スプリットラップタイマーウィンドウを設定して、流速制御ソフトウェアとコンピューター画面上のタイマーウィンドウに同時にアクセスできるようにします。次に、水泳トンネルから取り除かれた後、疲れ果てた魚を収容するための魚の収集タンクを設置します。収集タンクと長いポリ塩化ビニルチューブをゼブラフィッシュシステムの水で満たします。
予め充填されたチューブの一方の端を収集タンクに、もう一方の端をバッファタンクに配置して、水がバッファタンクから収集タンクに自由に流れるようにします。チューブの上端をバインダークリップで締めて水の流れを防ぎ、必要に応じてバインダークリップを使用して水の流出を制御します。水泳トンネル内に魚の1つのグループを置く前に、水泳耐久蓋で水泳トンネルを閉じます。
魚をスイムトンネルと流れの方向に順応させるには、スプリットラップタイマーを起動し、最初の5分間は毎秒0センチメートル、次の5分間は毎秒9センチメートル、次の5分間は毎秒10センチメートルに現在の速度を調整します。順応後、プロトコルを開き、自動流速制御プログラムを起動すると、毎分毎秒2センチメートルの水流速度が増加します。疲労のために魚を監視します。
疲れ果てた魚は、スイムトンネルの後端に向かって押し出されます。魚が疲れ果てていることを確認するには、トンネルの後端をそっとタップするか、その領域に影を作成して魚が泳ぐように刺激します。疲れ果てた魚は驚愕の刺激に反応せず、トンネルの後端に平らに横たわっていた。
魚が使い果たされたら、魚の収集チューブのクランプを外します。スイムトンネルの窓を開け、収集タンクに魚を集めます。スプリットラップタイマーを使用して疲労時のタイムを記録します。
すべての魚が使い果たされて収集タンクに集められたら、流速制御ソフトウェアの緊急停止ボタンをクリックしてタイマーを停止します。水泳行動アッセイ用のムービーをキャプチャするには、魚のグループを水泳トンネルに入れ、標準の完全に密閉された蓋を使用してトンネルを閉じます。次に、新しい記録ウィンドウを開き、ファイルに名前を付けます。
[記録] をまだクリックしないでください。新しい実験を始める前に、ペーパータオルまたは布片を水泳トンネルの側面に置き、すべての行動が魚の泳ぎによるものであり、環境内の動きによって引き起こされる驚愕反応によるものではないことを確認してください。水が穏やかで、フレームを横切って波紋が動いていないことを確認したら、カメラソフトウェアウィンドウで[録画]をクリックしてムービーファイルの録画を開始します。
次に、流速制御ソフトウェアで[開始]をクリックしてプロトコルを開始し、中断することなく続行します。ムービーを見て、フレームがドロップされていないこと、視野に泡がないこと、およびすべての魚が記録されていることを確認します。動画撮影が完了したら、緊急停止をクリックして流速制御プロトコルを終了し、データ出力ファイルが自動的に保存されることを確認します。
次に、録画ウィンドウを閉じてムービーファイルを保存します。録音後、蓋を外します。慎重に魚を回収し、彼らのタンクに戻します。
キャプチャしたムービーを分析するには、tracking_v2を開きます。フィジーのijmスクリプトをクリックし、[実行]をクリックしてプログラムを開始します。ポップアップウィンドウで、追跡する水泳動作ムービーを含むフォルダを選択し、[開く]をクリックします。
最初の映画のフレーム 1 、ダイアログ ボックス、および表示される関心領域 (ROI マネージャー) を探します。ダイアログ ボックスの指示に従って、スイム トンネル チャンバーの下部に ROI を作成します。次に、[OK]をクリックして、黒い角が見えないことを確認します。
しきい値ウィンドウが開き、編集されたしきい値フレームが開きます。配色を白黒から赤に変更し、フレーム1が魚を赤でしか表示しなくなるまで最大値を調整します。しきい値を記録し、ダイアログボックスで「OK」をクリックします。
整列、組み立て、および記述統計量の取得を行うには、SwimBehavior_v7-3を開きます。RStudio の R スクリプトと、スクリプト セクションの右上隅にある [ソース] をクリックします。開いた新しいウィンドウで、_rawを含むフォルダを選択します。
フィジーによって生成されたcsvファイルをクリックし、[開く]をクリックします。プログラムは自動的に実行されます。ポップアップダイアログボックスで、各ムービーの魚の数を確認します。
指定された番号が正しい場合は[はい]をクリックし、番号が正しくない場合は[いいえ]をクリックします。ファイルが整列したら、新しく生成された_alignedを確認します。csv ファイル。
プログラムがデータを結合し、統計を実行し、出力グラフをプロットすることを確認したら、_rawを含む親フォルダ内の Results というラベルの付いた新しいフォルダに生成された解析ファイルを確認します。csv と _aligned。csv ファイル。
怪我後2週間、4週間、6週間で評価された水泳持久力は、2週間で水泳持久力の60%の損失を示しました。再生した魚は、怪我から4週間と6週間後に徐々に泳ぐ持久力を取り戻しました。遊泳行動アッセイにおいて、対照は、上昇したY位置に対応する遊泳トンネルチャンバの前部で着実に泳いだ。
対照的に、怪我をしてから2週間後、怪我をした魚は流れに対して安定した泳ぎ能力を維持することができませんでした。その結果、彼らの水泳トラックはより不規則になり、Y位置が全体的に減少します。Y位は傷害後4週間および6週間で増加し、再生動物が徐々に泳ぐ能力を取り戻したことを示している。
さらに、無傷の対照と比較して、傷害後2週間の病変動物は著しく活動性が低く、水泳トンネルの後方象限で失速し、低電流速度に対して泳ぐ能力を失った。機能回復を達成する生来の能力と一致して、病変した動物は、傷害後4週間および6週間で徐々に水泳行動パラメータを正常化した。このプロトコルでの流速制御ソフトウェアの使用はオプションです。
代替案は、水流モーターを手動で制御することです。この研究で記載されたアッセイは、神経、筋肉、または骨格表現型を事前にスクリーニングするために使用することができる。次いで、関心のある組織を採取して、組織学的または分子学的検査を受けることができる。
私たちの研究室などは、このプロトコルを使用して、先天的な神経修復に必要な遺伝子と神経再生を促進するのに十分な因子を特定しました。
