אנו מודים לצימרמן על הטיפול בדגים, כמו גם לד"ר תומאס ביס, ד"ר קתרין פפפרלי ולאה גיגון על ייזום הפרויקט ותוצאותיהם הראשוניות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ, מענק מספר 310030_208170.

מחקר זה נערך בהתאם לכל כללי האתיקה הרלוונטיים. דגי הזברה גודלו וגודלו ותוחזקו בהתאם להנחיות הפדרציה האירופית למדעי חיות מעבדה (FELASA)25. שיכון בעלי החיים וכל הליכי הניסוי אושרו על ידי המשרד הווטרינרי הקנטונלי של פריבורג, שוויץ.
1. ציוד והתקנה
<ol><li>לארגן את הייצור של cryoprobe נירוסטה בסדנה טכנית שיכולה לייצר מכשירים למחקר. הערה: ספק עיצוב של המכשיר עם המידות הספציפיות (איור 1A).</li>
	<li>כדי למנוע כוויות קור בעת הטיפול בבדיקה במהלך ההליך, הכנס את הידית לקצה פיפטה ועטוף אותה בנייר דבק.</li>
	<li>הכינו לתמיסת העבודה בהרדמה, כף לטיפול בדגים, ספוג לח ומיכל עם מי מערכת כדי לאפשר לדגים להתאושש לאחר ההליך.</li>
	<li>הכינו את פתרון העבודה טרי לפני כל ניסוי. כדי להכין את פתרון העבודה, הוסף 4 מ"ל של תמיסת מלאי טריקאין ל -100 מ"ל של מי מערכת בכד. הערה: תמיסת מלאי ההרדמה מורכבת מ-4 גרם טריקאין מומס ב-980 מ"ל מים מזוקקים. לאחר התאמת ה- pH ל- 7 עם 1 M Tris-HCl, pH 9, מלא את התמיסה ל- 1 L במים מזוקקים. תמיסת המלאי רגישה לאור ויש לאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C בבקבוק ענבר.</li>
</ol>2. הליך cryoinjury שרירים
<ol><li>התחל את ההליך על ידי טבילת הבדיקה בחנקן נוזלי למשך 3 דקות לפחות. הרטיבו את הספוג במי המערכת והניחו אותו על משטח שטוח.</li>
	<li>העבירו דג זברה בוגר אחד לתמיסת העבודה של הטריקאין, ואשרו את חוסר התגובה שלו על ידי נגיעה עדינה בדג עם הכפית לאחר דקה או 2 דקות. אם הדג עדיין תגובתי, חכו עוד קצת.</li>
	<li>הניחו את הדג המרדים על הספוג הרטוב. אתר את הפדונקל הקאודלי אחורי לסנפיר פי הטבעת וקדמי לסנפיר הקאודלי.</li>
	<li>הסר את cryoprobe מן החנקן הנוזלי. נערו את הגשושית בעדינות כדי לוודא שלא נותרו שאריות חנקן נוזלי בקצה.</li>
	<li>הניחו את קצה המרית בניצב לגוף על הפדונקל הקאודלי (איור 1C). שמרו על הגשושית במצב הזה במשך 6 שניות בלי להפעיל לחץ (איור 1D). הערה: משקל ההקפאה מספיק כדי להבטיח מגע בין המכשיר לרקמה.</li>
	<li>שחרר את cryoprobe מן הרקמה, ולהעביר את הדגים לתוך המיכל עם מי המערכת.</li>
	<li>יש לעקוב אחר הדג בזמן שהוא חוזר לנשום ולשחות לאחר שהתעורר מההרדמה. אם תנועות אופרקולריות אינן מתרחשות לאחר 30 שניות, עוררו את הדג על ידי הזרמת מים לתוך הזימים עד שבעל החיים מתחיל נשימה בעצמו. הערה: על הדג לחזור לשחות תוך מספר דקות במיכל ההתאוששות. הערה: בימים שלאחר מכן, ניתן לצלם את הדגים כדי לעקוב אחר פעילות השחייה שלהם (וידאו 1 ווידאו 2). לפני הקלטת הווידאו, העבירו את הבקר והדגים הפצועים למיכל הזדווגות שקוף, ותנו להם להתרגל לפחות דקה אחת.</li>
</ol>3. איסוף פדונקל קאודלי וקיבוע
<ol><li>הכינו 2 מ"ל של 4% פורמלין או קיבוע אחר המתאים לבדיקות הבאות, צלחת פטרי, מלקחיים ומספריים כירורגיים.</li>
	<li>יש להרדים את הדג בנקודת זמן נבחרת לאחר ההקפאה בהתאם להיתר החוקי שניתן על ידי המשרד הווטרינרי האזורי. הערה: המתת חסד מבוצעת על ידי מנת יתר של תמיסת טריקאין (300 מ"ג / ליטר) במשך כ -10 דקות. אובדן תנועת הזימים ורפלקס צביטת סנפיר הזנב מאשר את המוות. יש לבחור את נקודות הזמן של המתת חסד בהתאם לשלב ההתחדשות: לדוגמה, מ 1 יום לאחר cryoinjury (dpci) ל 3 dpci עבור פינוי הפצע; מ 3 DPCI ל 10 DPCI עבור ייזום התחדשות שרירים; מ 10 DPCI ל 30 DPCI עבור התחדשות מתקדמת; ואחרי 30 DPCI להשלמת שיקום רקמות. לכן, כדי להעריך את השלבים השונים ואת התהליכים הביולוגיים של ניוון שרירים והתחדשות, קבוצות של דגים צריך להיות מאומת בנקודות זמן שונות לאחר cryoinjury.</li>
	<li>הניחו את הדג שעבר המתת חסד בצלוחית פטרי המכילה מים שעברו דה-יוניזציה. השתמשו במספריים כדי לבצע חתך דרך הגוף הקדמי והאחורי לפדונקל הקאודלי (איור 1E). תנו לרקמה לדמם החוצה במים נטולי היונונים של צלחת הפטרי.</li>
	<li>לאסוף את peduncle קאודלי, ולהעביר אותו עם מלקחיים לתוך פתרון קיבוע מוכן בצינור microcentrifuge. הערה: הפוך בזהירות את הצינורות מספר פעמים, ושמור אותם למשך הלילה ב 4 ° C.</li>
</ol>4. הרכבת הפדונקל הקאודלי
<ol><li>שטפו את הרקמה הקבועה ב-1x PBS למשך 10 דקות על נדנדה. לאחר מכן, להעביר אותו לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל עם מקורר מראש 30% סוכרוז במים deionized ב 4 ° C, בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים. השאר את צינורות microcentrifuge לפחות 24 שעות ב 4 °C במצב זקוף. הערה: הפדונקל הקאודלי יצוף על גבי תמיסת הסוכרוז ויתחיל לשקוע כאשר הרקמה מתייבשת.</li>
	<li>ממלאים תבנית הטבעה בשכבה 5 מ"מ של אמצעי הרכבה O.C.T. השתמש במלקחיים כדי להתאים את הפדונקל הקאודלי בתווך. הניחו אותו בתחתית התבנית, והתאימו את כיוונו לחתכים רוחביים או קורונליים (איור 1F).</li>
	<li>תן למדיום להקפיא בקופסת קרח יבש. ברגע שהרקמה מיוצבת במיקום הרצוי, ממלאים את שאר התבנית לפני שה- OCT קופא לחלוטין. אחסנו את התבנית למשך שעה לפחות בטמפרטורה של -80°C. הערה: בתנאים אלה, ניתן לאחסן את הרקמות במשך חודשים רבים.</li>
</ol>5. חיתוך החלקים עם cryostat
<ol><li>הגדר cryostat עם עובי חיתוך של 25 מיקרומטר. כוונן את טמפרטורת התא ל-26°C-, את טמפרטורת הדגימה ל-24°C ואת זווית החיתוך ל-12°.</li>
	<li>מניחים את הגוש הקפוא עם הדגימה בהקפאה, וקובעים את כיוונו על מנת לחתוך במקביל לתחתית הבלוק. גזור עד שתגיע לדגימה, ולאחר מכן חתוך את הבלוק כדי להקל על איסוף הדגימה.</li>
	<li>הכינו שש שקופיות הדבקה. תייג את השקופיות במספרים עוקבים כדי להכין עותקים משוכפלים של הדגימה.</li>
	<li>התחל לחתוך, ואסוף את קטעי הרקמה בשקופיות ההדבקה המסומנות. סדרו את הקטעים בשקופיות בהתאם לדרישות הניסוי הנוספות.</li>
	<li>הניחו למגלשות להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. אחסנו אותם בקופסאות סגורות בטמפרטורה של -20°C. הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בבטחה במצב זה למשך עד שנה אחת.</li>
</ol>

פדונקל קאודלי Cryoinjury בדגי זברה בוגרים

<ol>
	<li>Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+regeneration+and+regenerative+medicine.">Mammalian regeneration and regenerative medicine.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 84 (4), 265-280 (2008).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+principles+of+regeneration+in+mammalian+systems.">Some principles of regeneration in mammalian systems.</a> Anatomical Record. Part B, New Anatomist. 287 (1), 4-13 (2005).</li><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. -. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration.">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Tulenko, F. J., Currie, P., Cartner, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+myology.">Zebrafish myology.</a> The Zebrafish in Biomedical Research. , 115-121 (2020).</li><li>Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myogenic+precursor+cell+that+could+contribute+to+regeneration+in+zebrafish+and+its+similarity+to+the+satellite+cell.">A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell.</a> The FEBS Journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).</li><li>Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+volumetric+muscle+loss+injury.">Pathophysiology of volumetric muscle loss injury.</a> Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).</li><li>Pfefferli, C., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">The art of fin regeneration in zebrafish.</a> Regeneration. 2 (2), 72-83 (2015).</li><li>Sehring, I. M., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+understanding+fin+regeneration+in+zebrafish.">Recent advancements in understanding fin regeneration in zebrafish.</a> WIREs Developmental Biology. 9 (1), 367 (2020).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Sanz-Morej&#243;n, A., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+zebrafish+cardiac+regeneration.">Recent insights into zebrafish cardiac regeneration.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 37-43 (2020).</li><li>Chassot, B., Pury, D., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+fin+regeneration+after+cryoinjury-induced+tissue+damage.">Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage.</a> Biology Open. 5 (6), 819-828 (2016).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Developmental Biology. 11, 21 (2011).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).</li><li>Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cardiac+regeneration-Looking+beyond+cardiomyocytes+to+a+complex+microenvironment.">Zebrafish cardiac regeneration-Looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment.</a> Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 533-548 (2020).</li><li>Ja&#378;wi&#324;ska, A., Sallin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+versus+scarring+in+vertebrate+appendages+and+heart.">Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart.</a> Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).</li><li>Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orientation+of+muscle+fibres+in+the+myomeres+of+fishes.">The orientation of muscle fibres in the myomeres of fishes.</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 49, 163-290 (1969).</li><li>Morin-Kensicki, E. M., Melancon, E., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+relationship+between+somites+and+vertebral+column+in+zebrafish.">Segmental relationship between somites and vertebral column in zebrafish.</a> Development. 129 (16), 3851-3860 (2002).</li><li>Berberoglu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite-like+cells+contribute+to+pax7-dependent+skeletal+muscle+repair+in+adult+zebrafish.">Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish.</a> Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).</li><li>Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+muscle+regeneration+in+zebrafish+models+of+muscle+disease.">Examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62071 (2021).</li><li>Pipalia, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+regeneration+reveals+role+of+two+distinct+Pax7+stem+cell+populations+in+larval+zebrafish+muscle+repair.">Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).</li><li>Ratnayake, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+provide+a+transient+muscle+stem+cell+niche+via+NAMPT+secretion.">Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion.</a> Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).</li><li>Kaliya-Perumal, A. -. K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+regeneration:+A+zebrafish+perspective.">Musculoskeletal regeneration: A zebrafish perspective.</a> Biochimie. 196, 171-181 (2022).</li><li>Alestr&#246;m, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Housing+and+husbandry+recommendations.">Zebrafish: Housing and husbandry recommendations.</a> Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2019).</li><li>Saera-Vila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+dedifferentiation+drives+extraocular+muscle+regeneration+in+adult+zebrafish.">Myocyte dedifferentiation drives extraocular muscle regeneration in adult zebrafish.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (8), 4977-4993 (2015).</li><li>Baust, J. G., Gage, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+cryosurgery.">The molecular basis of cryosurgery.</a> BJU International. 95 (9), 1187-1191 (2005).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+cell+death:+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2018.">Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).</li><li>Chablais, F., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myocardial+infarction+in+adult+zebrafish+using+cryoinjury.">Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).</li><li>Chablais, F., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+the+zebrafish+heart+is+dependent+on+TGFbeta+signaling.">The regenerative capacity of the zebrafish heart is dependent on TGFbeta signaling.</a> Development. 139 (11), 1921-1930 (2012).</li><li>Bise, T., Sallin, P., Pfefferli, C., Ja&#378;wi&#324;ska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cryoinjuries+modulate+the+efficiency+of+zebrafish+heart+regeneration.">Multiple cryoinjuries modulate the efficiency of zebrafish heart regeneration.</a> Scientific Reports. 10 (1), 11551 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

דג הזברה מספק אורגניזם מודל של חולייתנים אנמניוטים לחקר מנגנוני התחדשות השרירים. רוב שיטות הפציעה הקיימות, כגון אבלציה בלייזר או פצע דקירה, גורמות להפרעה קלה יחסית ברקמה20,21,22,23. כריתות גדולות בוצעו בשריר חוץ-עיני26. עם זאת, גישה כירורגית זו תהיה כנראה פחות מתאימה לשרירים הרוחביים בשל הסכנות הבריאותיות של חיתוך דופן הגוף. כדי להימנע מהליכים פולשניים כאלה, פרוטוקול זה מתאר צורה קלה יותר של פציעה, שבכל זאת גורמת נזק עמוק לפדונקל הקאודלי. גישה זו מסתמכת על מניפולציה שטחית המאפשרת מיקוד מדויק מאוד של כמה מיומרים בצד אחד של הגוף. נקודות החוזק של מודל cryoinjury טמונות ביכולת השחזור שלו וביכולתו לייצר ניוון שרירים נרחב; בהתבסס על חוזקות אלה, מודל זה מספק נתיב חדש לחקור כיצד הגוף מגיב לאובדן שרירים משמעותי.
היישום של קור קיצוני מוביל להלם תרמי, אשר הורס את קרום פלזמה אברונים ברקמת השריר מושפע27. כתוצאה מכך, שרירי השריר הפגועים עוברים מוות תאי "מקרי"28. כתוצאה מכך, הרקמה הפגועה יכולה להיספג מחדש על ידי מנגנונים טבעיים של פינוי פצעים. דגי זברה סובלים היטב את הליך ההקפאה, שכן שיעור ההישרדות במחקר זה היה כמעט 100%, בהתחשב בכך שהגשושית המקוררת מראש הייתה ממוקמת נכון על הגוף למשך הזמן המדויק. עם זאת, אם הפצע נרחב מדי (למשל, אם מופעל לחץ רב מדי או משך ההקפאה ארוך מדי), הדג עשוי להציג תנועות שחייה חריגות זמן קצר לאחר ההליך, ויש להרדים את בעל החיים כנקודת קצה אנושית. עבור מיני דגים אחרים, יש להתאים את זמן החשיפה לקריופרוב בהתאם לגודל הגוף.
לאחר הקפאה, הדגים יכולים לחדש את פעילות השחייה שלהם ללא כל תסמינים של תנועה חריגה. עם זאת, דגים קריו-פצועים שוחים פחות באופן דינמי מדגי ביקורת, מה שמצביע על כמה ליקויים קלים. יהיה צורך בכימות נוסף של התנהגות הדגים בנקודות זמן שונות לאחר הקפאה כדי לקבוע שינויים זמניים בביצועי השחייה.
ההשפעה של שיטת cryoinjury על רקמות אחרות שאינן שריר של peduncle caudal נשאר להבהיר. ברור ששכבת הגוף החיצונית ביותר (כלומר, העור) נפגעת מההליך. בהקשר זה, שיטת cryoinjury יכולה לספק אסטרטגיה חדשה לחקר ריפוי פצעים, התחדשות קנה מידה, ושחזור דפוס פיגמנטציה. יתר על כן, כלי הדם והעצבוב של המיאומרים יכולים להיות מושפעים גם על ידי cryoinjury, ונושאים אלה דורשים חקירה נוספת.
מודל cryoinjury שימש בעבר לחקר התחדשות הלב של דגי זברה13,14,15,29. שיטה זו הראתה כמה יתרונות בהשוואה לשיטת כריתת החדרים10 בשל שקיעת צלקת עשירה בקולגן, המחקה טוב יותר את תגובת הריפוי של אוטם בבני אדם30. למרבה הפלא, דגי זברה יכולים לחדש את ליבם לאחר פציעות קריו-מרובות31. באופן מעניין, cryoinjury יושם גם על סנפיר דג הזברה, וכתוצאה מכך תהליכים היסטוליטיים12. בניגוד לקטיעת הסנפיר הקלאסית, הגדם הקריופצוע הנותר מכיל שוליים מעוותים עם תערובת של חומר מת ותאים בריאים. מחקרים עם שני איברי דגי הזברה, הלב והסנפיר, חשפו את היכולת החזקה של דגי הזברה לשחזר את המרכיבים הפונקציונליים המקוריים שלהם גם לאחר נזק נרחב לרקמות. השאלה אם שריר השלד הפצוע בהקפאה מפעיל יחסי גומלין בין תהליכים מתקנים ורגנרטיביים מצדיקה מחקרים עתידיים.

אצל בעלי חוליות, חלקים פגועים של רקמות שונות עוברים התחדשות ושיקום הומיאוסטטיים במהלך החיים. יכולת זו להתחדשות ושיקום תלויה בדרך כלל בנוכחות תאי גזע מוכשרים או ביכולת ההתרבות של התאים הבוגרים 1,2. שרירי השלד מורכבים ממיוסיבים פוסט-מיטוטיים, הקשורים לתאי גזע מקומיים, הנקראים תאי לוויין 3,4,5,6. לפיכך, רקמה זו מכילה מקורות סלולריים לאיטום יעיל של אזורים של רצף קטוע או לתיקון פצעים קלים. עם זאת, הפסדים נפחיים גדולים יותר בשרירי השלד של יונקים מלווים לעתים קרובות בתיקון לא רגנרטיבי, כגון פיברוזיס7. מודלים של בעלי חיים יכולים לספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים הביולוגיים המקדמים התחדשות של איברים שניזוקו באופן נרחב.
דג הזברה הוא אורגניזם מודל מבוסס היטב עם יכולת התחדשות גבוהה. דגי זברה בוגרים יכולים לחדש חלק קטוע של הסנפיר הקאודלי שלהם או את הקודקוד המנותח של חדר הלב 8,9,10,11. בנוסף, שיטת cryoinjury יושמה בעבר לחקר סנפיר והתחדשות לב בדגי זברה12,13,14,15. במקרה של איברים פנימיים, לשיטת cryoinjury יש את היתרון של גרימת מוות תאי מבלי לשבש את שלמות האיברים, ובכך לחקות תנאים פיזיולוגיים16,17. פסולת רקמות מתפרקת על ידי פינוי טבעי במהלך ריפוי הפצע, ואחריו תהליכי תיקון. עם זאת, עדיין לא ברור אם ניתן ליישם שיטה זו על שרירי השלד.
בדגים, השרירים הרוחביים מאפשרים כיפוף מצד לצד של החדק במהלך שחייה18. שרירי השלד מאורגנים ביחידות מטמריות, הנקראות מיומרים, המופרדות על ידי רקמת חיבור 5,19. דגי זברה יכולים לחדש את שריריהם לאחר הפרעות קלות ברקמות, כגון אלה הנגרמות על ידי אבלציה בלייזר או פצע דקירה 20,21,22,23,24, אך עדיין לא ידוע אם מיומרים שלמים יכולים להתחדש לאחר פציעה נרחבת. פער הידע הזה נובע כנראה מהיעדר מודל פגיעה מתאים. פרוטוקול זה קובע גישה חדשה לגרימת פציעה נרחבת של שריר השלד, המשתרעת על פני מספר מיומרים. שיטת cryoinjury המתוארת מבוססת על הקפאה והפשרה מהירה של myofibers עם מכשיר נירוסטה מקורר מראש. למרות הנזק הרב, רווחתם של הדגים לא נפגעה קשות. מיומרים שלמים יכולים להיות משוחזרים, ולכן עבודה זו מספקת מערכת מודל חדשה לחקר מנגנוני התחדשות השרירים בדגי זברה בוגרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Program</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop Version 23.5.3</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/ Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35/10 mm Petri Dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>Item No.: 627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>/</td>
			<td>HDR-PJ410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Histcom</td>
			<td>HRA C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde ~36%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>/</td>
			<td>Discontinued lense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8</td>
			<td>Polyscience, Inc.</td>
			<td>18985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost Plus</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td>any</td>
			<td>any</td>
			<td>flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cryoprobe</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>/</td>
			<td>specifics in the article</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>/</td>
			<td>Discontinoued product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Anestethic)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes and Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Concentration: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-Atto-565 (F-actin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94072</td>
			<td>Concentration: 1 / 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin (TPM1)</td>
			<td>DHSB</td>
			<td>CH1</td>
			<td>Concentration: 1 / 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipies/Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>123 mM NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.7 mM KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 mM Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1.8 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFOG solution</td>
			<td>3 g Fuchsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 g Orange G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 g Anilin blue</td>
			<td>Fulka AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cryoinjury model for studying skeletal muscle regeneration of the caudal peduncle in adult zebrafish

שרירי השלד עוברים התחדשות ושיקום לאחר פציעה קלה באמצעות הפעלת תאי גזע דמויי לוויין. פציעות חמורות של השרירים לעיתים קרובות להוביל פיברוזיס בבני אדם. בהשוואה ליונקים, לדגי זברה יש יכולת מולדת גבוהה יותר להתחדשות איברים, מה שמספק מודל רב עוצמה לחקר שיקום רקמות לאחר נזק נרחב לאיבר. כאן, מודל cryoinjury מתואר כגורם נזק עמוק לארבעה מיומרים של הפדונקל הקאודלי בדגי זברה בוגרים. קריופרוב בהתאמה אישית תוכנן כך שיתאים לצורת הגוף ויפצע באופן בלתי ניתן לשחזור את השרירים הרוחביים מהעור לקו האמצע. חשוב לציין כי שלמות הגוף נותרה ללא פגע, והדגים המשיכו בפעילות השחייה שלהם. שינויים בשרירי השלד הוערכו על ידי צביעה היסטולוגית וצביעה פלואורסצנטית של חלבונים סרקומריים על חלקי רקמות. שיטה זו תפתח כיווני מחקר חדשים שמטרתם להבין כיצד ניוון שריר השלד גורם לתגובות מתקנות ובכך להפעלה מחדש של התוכנית המיוגנית בדגי זברה בוגרים.

In vertebrates, damaged parts of various tissues undergo homeostatic renewal and restoration during the lifespan. This capacity for renewal and restoration typically depends on the presence of competent stem cells or the proliferative capacity of the mature cells1,2. Skeletal muscle comprises post-mitotic myofibers, which are associated with local stem cells, called satellite cells3,4,5,6. Thus, this tissue contains cellular sources for the efficient sealing of areas of interrupted continuity or for the repair of minor wounds. However, larger volumetric losses in mammalian skeletal muscle are often followed by non-regenerative repair, such as fibrosis7. Animal models could provide new insights into the biological mechanisms that promote the regeneration of extensively damaged organs.
The zebrafish is a well-established model organism with a high regenerative capacity. Adult zebrafish can regenerate an amputated part of their caudal fin or the resected apex of the cardiac ventricle8,9,10,11. In addition, a cryoinjury method has previously been applied to study fin and heart regeneration in zebrafish12,13,14,15. In the case of inner organs, the cryoinjury method has the advantage of inducing cell death without disrupting the organ integrity, thus mimicking physiological conditions16,17. Tissue debris is disintegrated by natural clearance during wound healing, followed by the reparative processes. However, whether this method could be applied to skeletal muscle remains to be established.
In fish, the lateral musculature enables the side-to-side bending of the trunk during swimming18. The skeletal muscles are organized into metameric units, called myomeres, which are separated by connective tissue5,19. Zebrafish can regenerate their muscle after minor tissue disruptions, such as those caused by laser ablation or a stab wound20,21,22,23,24, but whether whole myomeres can regenerate after extensive injury remains unknown. This gap in knowledge is probably due to the lack of a suitable injury model. This protocol establishes a new approach to induce extensive injury of the skeletal muscle, spanning multiple myomeres. The described cryoinjury method is based on the rapid freezing and thawing of the myofibers with a precooled stainless-steel instrument. Despite the extensive damage, the well-being of the fish was not severely impaired. Entire myomeres could be restored, and, thus, this work provides a new model system for studying the mechanisms of musculature regeneration in adult zebrafish.

מחבר זרקור: מודל Cryoinjury לחקר התחדשות שרירי השלד של הפדונקל הקאודלי בדגי זברה בוגרים  

מודל Cryoinjury לחקר התחדשות שרירי השלד של הפדונקל הקאודלי בדגי זברה בוגרים

Zebrafish models can help us understand the natural mechanisms of efficient organ regeneration. Our laboratory has previously established a cryo injury method for studying how zebrafish restore their heart and fitness. With this new protocol, we aim to expand our research into another organ, namely the musculature.We have yet to understand why organ regeneration is more efficient in zebrafish than in humans. This protocol provides a promising approach to studying the successful restoration of musculature despite a relatively large wound size in the fish body. This cryo injury model has at least three advantages.Firstly, the musculature is damaged rapidly and without disrupting the body's integrity. Secondly, the wound is reproducible and cleared by natural healing. And finally, fish can swim normally after cryo injury, suggesting a mild impact of this procedure on the animals.Our findings introduced the zebrafish caudal peduncle into the field of regenerative biology. This research path will contribute to deciphering the molecular mechanisms that guide the myogenesis program to reconstruct complex musculature in adult zebrafish.

ניטור של הדג לאחר cryoinjury כדי לקבוע את ההשפעה של cryoinjury myomere על בעלי חיים, הקלטת וידאו של שליטה דגים cryoinjury ב 1 ימים לאחר cryoinjury (dpci) ו 5 dpci בוצע. כל קבוצה הכילה חמישה דגים. ב-1 dpci, הדגים הקרופידיים שחו פחות באופן פעיל, אך הם לא הציגו תנועות חריגות, כגון הסתחררות, פיתול או שיווי משקל מופחת (וידאו 1). במערכת הגידול, מיקומם במיכל ובצריכת המזון היה דומה לזה של הדגים שלא נפגעו. ההתנהגות הרגילה נמשכה לאורך כל הימים הבאים, כפי שהודגם בסרטון ב- 5 dpci (סרטון 2). לסיכום, הליך cryoinjury של peduncle caudal לא השפיע קשות על רווחתם של בעלי החיים.
ניתוח היסטולוגי של קטעי הפדונקל הקאודלי כדי להעריך את היקף הפציעה, נבחרה נקודת הזמן של 4 dpci, שכן זה כאשר פסולת מיופייבר נספגה לחלוטין בפצע. כדי לנתח את ההשפעות של קריו-פציעה לאורך הצירים הגב-גחוני והקדמי-אחורי של הגוף, השתמשו בשתי קבוצות דגים (כלומר, חלקים קורונליים ורוחביים של הפדונקל הקאודלי, בהתאמה) (איור 1F).
הקטעים נותחו על ידי צביעת טריכרום המורכבת מכחול אנילין, חומצה פוקסין ותפוז G (AFOG). באמצעות שילוב זה של ריאגנטים, שרירים שלמים הוצגו בכתום, חוט השדרה באדום כהה, ומטריצת הקולגן בכחול. כדי לקבוע את מספר המיאומרים הפגועים, שהם היחידות המטמריות של שרירי הדגים, נותחה סדרה של מקטעים (איור 2). גבולות מיומרים, הנקראים מיוקומטה, זוהו על ידי שקיעת קולגן, כפי שזוהה על ידי צבע כחול. האזורים הפגועים נקבעו על ידי היעדר כתמים כתומים. בחינה מדוקדקת יותר של דגימות עם מיוקומטות ניכרות גילתה כי כארבעה מיומרים רצופים ניזוקו, כפי שהוסק מהיעדר כתמים כתומים (n, מספר דגים = 4; איור 3א,א'). הצד הלא פצוע של אותו דג שימש כנקודת ייחוס פנימית.
כדי לבחון את עומק הפצע בניצב לציר הגוף, הוכנו חתכים רוחביים באמצעות דגי זברה בעוצמה של 4 dpci ו-7 dpci. נקודת הזמן האחרונה תואמת את ההפעלה של התוכנית המיוגנית, ובכך, את תחילת התחדשות השרירים. צביעת AFOG של הדגימות האלה הראתה מחסור נרחב בכתמים כתומים באגף הקפואה של הגוף, התוחם את האזור של שרירי השלד המנוונים (איור 3B,C). ב 4 dpci ו 7 dpci, אזור הפצע השתרע רקמות מן העור לכיוון המחיצה האנכית. זה מדגים כי שיטת cryoinjury התמקדה עמוק חצי צדדי אחד של peduncle caudal, אשר נשאר ללא שריר פונקציונלי במשך 7 ימים לאחר ההליך. יחד, ארבעה מיומרים ניזוקו עמוקות בצד אחד של הפדונקל הקאודלי.
ניתוח immunofluorescence של החלקים הרוחביים כדי להעריך את הדינמיקה של התחדשות שרירים, קבוצות ניסוי של דגים הומתו ב 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci, ו 30 dpci. החלקים הרוחביים של הפדונקל הקאודלי סומנו על ידי צביעה פלואורסצנטית צבעונית באמצעות פאלואדין (שנקשר לאקטין נימה [F-actin]), נוגדן טרופומיוזין-1, המזהה חלבון סרקומרה, ו- DAPI, המסמן גרעינים. בכל נקודות הזמן, המחצית הלא נפגעת של הגוף סיפקה בקרה פנימית; גם F-actin וגם Tropomyosin 1 זוהו בחוזקה בחלקי הבקרה שלא נפגעו, מה שמצביע על רקמה שלא ניזוקה (איור 4).
ב-4 dpci, הצד הפגוע של הפדונקל הקאודלי הכיל שפע של תאים חיוביים ל-DAPI, אולם נצפו מעט מאוד F-אקטין וטרופומיוזין 1 אימונופלואורסצנטיים, מה שמצביע על אזור הפצע עם שרירים מנוונים (איור 4A-B'). ב-7 dpci, טרופומיוזין 1 ו-F-אקטין יכולים להיות מזוהים בחלק של הפצע קרוב לקו האמצע האנכי של הגוף (איור 4C-D'). דפוס ביטוי זה תוחם את המיקום שבו מתחילה היווצרות של מיופייברים חדשים בפדונקל הקאודלי. ב-10 dpci, שני סמני השרירים התרחבו לכיוון פני השטח של הגוף, מה שמרמז על התחדשות מתקדמת של שריר השלד (איור 4E-F'). ב-30 dpci, שני צידי הגוף הראו התפלגות דומה של צביעת F-אקטין (איור 4G-H'). ממצא זה מצביע על כך ששריר השלד שוקם ביעילות לאחר הקפאת הפדונקל הקאודלי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig01.jpg"> איור 1: התקנה ניסיונית עבור myomere cryoinjury. (A) מידות ה-cryoprobe המיוצר בהתאמה אישית עשוי מפלדת אל-חלד. החלק הדיסטלי של המכשיר מורכב מרית עם קצה קעור בעומק של 1 מ"מ כדי להסביר את העקמומיות של גוף דג הזברה. החלק האמצעי של הכלי כולל גליל המתפקד כמשקולת ומאגר לשמירה על הטמפרטורה הנמוכה של המרית במהלך ההליך. הקצה הפרוקסימלי של המכשיר הוא בצורת ידית מתכת דקה. (ב,ג) דג בוגר מורדם על ספוג לח עם cryoprobe על peduncle קאודלי. הגשושית הייתה בטמפרטורת החדר. (B) שולי הגשושית ממוקמים אופקית בקרבת הפדונקל הקאודלי כדי להציג את הגודל היחסי בין הדג לכלי. (C) עבור cryoinjury, קצה הכלי ממוקם בניצב לדג. (D) המחשה סכמטית של הליך ההקפאה מהצד הגחוני של הדג כדי להראות את המניפולציות באופן מקיף. הקריופרוב היה מקורר מראש בחנקן נוזלי והונח מיד בצד אחד של הדג למשך 6 שניות. (E) בנקודת זמן מסוימת לאחר הקפאה, הדגים הומתו והפדונקלים הקאודליים שלהם נאספו לקיבוע. (F) החומר הקבוע עובד באופן היסטולוגי ונחתך לאורך מישור העטרה או המישור הרוחבי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig02.jpg"> איור 2: ניתוח היסטולוגי של מיומרים פגומים בפדונקל הקאודלי מהמיקום הגבי ועד למצב הגחוני של הגוף. צביעת AFOG של סדרה של חתכים קורונליים ב 4 ימים לאחר cryoinjury (dpci). החתכים הם מהגבי לכיוון הצד הגחוני, כפי שמצוין בחלק העליון של הלוח הראשון והאחרון. הקטעים אינם סמוכים, עם מרווח של כ -150 מיקרומטר ביניהם. השריר שלא נפגע מזוהה על ידי צביעה כתומה של השריר, ואילו הרקמה הפגועה חסרה את הכתם הזה ונראית אפרפרה (אזור מוקף בקו מקווקו). רקמות המכילות קולגן, כגון העור, מוכתמות בכחול. חוט השדרה מופיע כמבנה דמוי מוט ומוכתם באדום. מספר הדגים, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig03.jpg"> איור 3: הערכת עומק הפגיעה בפדונקל הקאודלי באמצעות צביעת AFOG. (א,א') החלק העטרתי נמצא בגובה חוט השדרה (מוט אופקי מוכתם באדום). התמונה התחתונה מציגה אזור מוגדל המוקף במסגרת בתמונה העליונה. גבולות המיומרים הרציפים מופיעים כפסים קולגנים (כחולים) הממוקמים באלכסון לחוט השדרה (חיצים אדומים בתמונה המוגדלת A'). (ב,ג) חתכי הרוחב מציגים את האגף שלא נפגע עם שרירים מוכתמים בכתום ואת האגף הקפואה עם כתמים אפרפרים. האזור הפגוע מוקף בקו מקווקו שחור. המחיצה האנכית (המתוארת בקו מקווקו אדום) מחלקת את הגוף לצדדי הבקרה וההקפאה. מספר הדגים, n = 4 לנקודת זמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig04.jpg"> איור 4: זיהוי אימונופלואורסצנטי של חלבוני שריר לאחר קריופציעה. צביעה פלואורסצנטית של חתכי רוחב ב- 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci ו- 30 dpci, כפי שמסומן בצד שמאל ובחלק העליון של הלוחות (A-B'). ב 4 dpci, הרקמה הפגועה (מוקפת בקו מקווקו) היא DAPI חיובי (כחול) אך ללא צביעת פלואדין (ירוק) או Tropomyosin-1 immunoreactivity (אדום), מה שמרמז על ניוון של סיבי השריר לאחר cryoinjury. (ג-ד') ב 7 dpci, שני סמני שריר מופיעים בהדרגה באזור הפגוע, המציין את תהליך ההתחדשות. Tropomyosin-1 נראה אינטנסיבי יותר מאשר F-actin בסיבים החדשים שנוצרו. (ה-ו') ב 10 dpci, אזור הפציעה מלא myofibers חדשים המציגים עוצמה גבוהה יותר של Tropomyosin-1 immunoreactivity בהשוואה F-actin. (ג-ח') ב 30 dpci, דפוס דומה של myofibers מזוהה בשני צידי הגוף. המסגרות בחלוניות A, C, E ו- H מקיפות את האזורים המוגדלים בתמונות הסמוכות מימין. קשקשים עוריים, הנובעים מפלואורסצנטיות מחוץ למיומר, נמחקו מהתמונות באמצעות Adobe Photoshop. מספר הדגים, n = 4 לנקודת זמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר מודל cryoinjury כדי לגרום נזק עמוק של כמה מיומרים caudal בדגי זברה בוגרים. שיטה זו מספקת גישה חדשה לחקר התחדשות שרירי השלד לאחר אובדן חמור של רקמה אצל בעלי חוליות שאינם יונקים.

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the ...

מודלים של דגי זברה יכולים לעזור לנו להבין את המנגנונים הטבעיים של התחדשות איברים יעילה. המעבדה שלנו פיתחה בעבר שיטת פציעה בהקפאה לחקר האופן שבו דגי זברה משחזרים את הלב והכושר שלהם. עם פרוטוקול חדש זה, אנו שואפים להרחיב את המחקר שלנו לאיבר נוסף, כלומר השרירים.עדיין לא הבנו מדוע התחדשות איברים יעילה יותר בדגי זברה מאשר בבני אדם. פרוטוקול זה מספק גישה מבטיחה לחקר שיקום מוצלח של שרירים למרות גודל פצע גדול יחסית בגוף הדג. למודל זה של פציעת קריו יש לפחות שלושה יתרונות.ראשית, השרירים נפגעים במהירות ומבלי לשבש את שלמות הגוף. שנית, הפצע ניתן לשחזור ולניקוי על ידי ריפוי טבעי. ולבסוף, דגים יכולים לשחות כרגיל לאחר פציעת קריו, מה שמרמז על השפעה קלה של הליך זה על בעלי החיים.הממצאים שלנו הכניסו את הפדונקל הקאודלי של דג הזברה לתחום הביולוגיה הרגנרטיבית. נתיב מחקר זה יתרום לפענוח המנגנונים המולקולריים המנחים את תוכנית המיוגנזה לשחזור שרירים מורכבים בדגי זברה בוגרים.

a-cryoinjury-model-for-studying-skeletal-muscle-regeneration-caudal

Research

JoVE Journal

Biology

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

1.2K Views.  University of Fribourg. מודלים של דגי זברה יכולים לעזור לנו להבין את המנגנונים הטבעיים של התחדשות איברים יעילה. המעבדה שלנו פיתחה בעבר שיטת פציעה בהקפאה לחקר האופן שבו דגי זברה משחזרים את הלב והכושר שלהם. עם פרוטוקול חדש זה, אנו שואפים להרחיב את המחקר שלנו לאיבר נוסף, כלומר השרירים.עדיין לא הבנ...

Video: מחבר זרקור: מודל Cryoinjury לחקר התחדשות שרירי השלד של הפדונקל הקאודלי בדגי זברה בוגרים  

Skeletal muscle undergoes renewal and restoration after minor injury through the activation of satellite-like stem cells. Severe injuries of the musculature often lead to fibrosis in humans. In comparison to mammals, zebrafish possess a higher innate capacity for organ regeneration, providing a powerful model for studying tissue restoration after extensive damage to the organ. Here, a cryoinjury model is described to induce profound damage to four myomeres of the caudal peduncle in adult zebrafish. A custom-made cryoprobe was designed to fit the body shape and reproducibly injure the lateral musculature from the skin to the midline. Importantly, the body integrity remained intact, and the fish continued their swimming activity. Changes to the skeletal muscle were assessed by histological staining and fluorescence staining of sarcomeric proteins on tissue sections. This method will open up new avenues of research aiming to understand how the degeneration of the skeletal muscle induces reparative responses and, thus, the reactivation of the myogenic program in adult zebrafish.

This protocol describes a cryoinjury model to induce profound damage of several caudal myomeres in adult zebrafish. This method provides a new approach for studying skeletal muscle regeneration after severe loss of tissue in non-mammalian vertebrates.

Performing Muscle Cryoinjury on a Zebrafish

For performing the myomere cryoinjury on zebrafish, use a custom manufactured stainless steel cryoprobe. To avoid frostbite while handling the probe during the procedure, insert the probe handle into a pipette tip and secure it by wrapping it with tape. Before beginning with the cryoinjury procedure, prepare a beaker for the anesthesia working solution, a spoon for handling the fish, a moist sponge, and a tank with system water for post-procedure recovery of the fish.Prepare the anesthesia stock solution following the steps shown on the screen. Then add four milliliters of the prepared stock solution to 100 milliliters of system water in a beaker to prepare the tricaine working solution. To begin the cryoinjury procedure, immerse the probe in liquid nitrogen for a minimum of three minutes.Wet the sponge in system water and place it on a flat surface. Then one to two minutes after transferring a single adult zebrafish into the tricaine working solution, confirm its unresponsiveness by touching the fish gently with the spoon. Place the anesthetized fish onto the wet sponge.Locate the caudal peduncle posterior to the anal fin and anterior to the caudal fin. At this stage, remove the cryoprobe from the liquid nitrogen. Shake the probe gently to ensure no residual liquid nitrogen remains on the tip.Place the edge of the spatula perpendicular to the body on the caudal peduncle. Keep the probe in this position for six seconds without applying pressure, before releasing the cryoprobe from the tissue. Then transfer the fish into the system water in the recovery tank.Monitor the fish while it resumes breathing and swimming after waking up from the anesthesia. If opercular movements do not occur after 30 seconds, stimulate the fish by pipetting system water into the gills until the animal initiates respiration by itself. Video recording of control and cryoinjured fish at one day post-injury or DPCI revealed that although the cryoinjured fish swam less actively, they did not display any abnormal movements, such as swirling, convolution, or reduced equilibrium.In the husbandry system, their position in the tank and food intake was similar to those of the uninjured fish. As observed at 5 DPCI, normal behavior was still persistent indicating the cryoinjury procedure did not severely affect the wellbeing of the animals.

ביצוע Cryoinjury שרירים על דג זברה

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.