このプロトコルの全体的な目標は、筋肉疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉再生を調べ、定量化することです。この方法は、費用対効果が高いだけでなく、in vivo設定で病気の筋肉の再生電位をスコアリングする上で非常に再現性の高い高スループットパイプラインを提供します。私と一緒に手順を実証することは、オーストラリア再生医学研究所の研究員であるアヴニカ・ルパレリアです。
生きた胚のジェノタイピングでは、24室のDNA抽出チップの上面から透明な保護フィルムを剥離し、カットチップ付きの20マイクロリットルフィルターチップを使用して、13マイクロリットルの胚培地中の単一の麻酔付き胚をチップの各チャンバーに移します。すべての胚がロードされたら、1つの側を最初に配置し、続いてチップの残りの部分を置くことによって、ゼブラフィッシュ胚ジェノタイピングプラットフォームにチップを静かに取り付けます。磁気プラットフォームの蓋をチップの上に貼り付けて、DNA抽出プロトコル中に胚媒体の蒸発を防ぎ、蓋を閉じます。
ベースユニットを2.4ボルト、0.051アンペア、0.12ワットに設定し、DNA抽出プロトコルを開始します。プラットフォームは、蓋を静かに触れることによって評価することができる振動を開始する必要があります。プログラムが実行されている間に、各ウェルに1ミリリットルの胚培地を加えて24ウェルプレートを準備し、各胚からのDNA材料の収集に使用される8ウェルストリップチューブにラベルを付けます。
8分間の抽出の後、オン/オフボタンを押してプラットフォームの振動を止め、磁気蓋を静かに取り外し、チップをプラットフォームから持ち上げます。1つのチャンバーから10マイクロリットルの胚培地を8ウェルストリップチューブの適切な井戸に移し、すぐに2滴の新鮮な胚培地をチャンバーに加える。胚をチャンバーから、以前に調製した24ウェルプレートの適切なウェルに移します。
すべての胚が移された時、プレートを28°Cのインキュベーターに入れる。8ウェルストリップチューブに集められた遺伝物質に対して適切な下流のジェノタイピングアッセイを実行し、各胚の遺伝子型を決定する。各胚の遺伝子型が同定されたら、25ミリリットルの中水を含む90ミリメートルのペトリ皿に胚を移し、筋肉が損傷するまで28°Cでプレートをインキュベートする。
受精後4日で、ピペットを使用して1匹の麻酔幼虫を新しいペトリ皿に移し、解剖顕微鏡で余分な培地を皿から慎重に取り除きます。魚の向きを左に、尾が右にあり、背部領域が上にあり、腹側領域が下がるように、30ゲージ針を使用して、肛門の上の精液筋の1〜2つのスマイトに迅速に正確な刺し傷を行い、ミオセプタムに水平に向けます。負傷したゼブラフィッシュに胚培地の滴を塗布し、幼虫を井戸あたり1ミリリットルの新鮮な胚培地を含む24ウェルプレートの1つの井戸に慎重に移します。
すべての幼虫が負傷した場合は、ゼブラフィッシュが画像化されるまで、プレートを28°Cのインキュベーターに入れる。筋肉の再生を定量化するには、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで 1 日の傷害後画像を開き、ポリゴン ツールを使用して創傷部位の周囲に図形を描画します。このソフトウェアを使用して領域を測定し、領域の複屈折強度を意味し、これらの値を提供されたテンプレートのセルD3およびE3にコピーします。
1~2個のスマイトにまたがる2つの追加領域をそれぞれ描き、その領域を測定し、これらの領域のそれぞれの複屈折強度を意味する。これらの値をテンプレートのセル D4 と D5、E4 および E5 にコピーします。その後、損傷後3日間の画像で同じ領域の測定を繰り返します。
複屈折が全ての画像で同様に測定された場合、各領域の平均複屈折強度をその領域で割って各領域の正規化複屈折を計算する。各時点について、2つの損傷のない領域の平均正規化複屈折を計算して、損傷していない筋肉の基準点を提供する。1日目の傷害後の筋肉損傷の程度を決定するために、傷害領域の正常化された複屈折を、損傷していない領域の平均正常化された複屈折で割る。
筋肉再生の程度を決定するために、損傷後3日間の傷害領域の正規化複屈折を、この段階での損傷していない領域の平均正常化された強度で割る。最後に、3日目の術後の筋肉再生の程度の値を、1日目の傷害後の筋肉損傷の程度の値で割って回生指数を計算する。この代表的な分析では、2つのLama2ヘテロ接合ゼブラフィッシュの間の十字架からの胚のクラッチをDNA抽出チップに移し、その後遺伝子型化した。
筋肉の傷害は、1日目の1日目の傷害後に複屈折強度の低下をもたらすが、筋肉の再生に成功すると、同じ領域内での複屈折の増加をもたらす。また、野生型の幼虫は正常な筋肉のパターニングに起因する均一な複屈折強度を示す一方で、Lama2ノックアウト幼虫の筋肉の複屈折強度は不均一であり、筋肉の完全性が低下する可能性が高い。観察されたように、野生型とLama2欠損幼虫の両方が、傷害後1日の1日に比べて傷害部位の複屈折強度が有意に増加したことを示し、筋肉が再生したことを示す。
再生指数の決定は、Lama2欠損幼虫が野生型動物と比較して筋肉再生の顕著な増加を示すことを明らかにする。このプロトコルは、筋肉疾患のモデルで再生する筋肉の能力の変化を特定することができますが、下流の細胞および分子分析は、観察された変化の原因となるメカニズムを特定するために行う必要があります。この方法により、筋幹細胞機能の障害や関連ニッチ元素の障害が筋疾患の病態にいかに寄与しているかを特定することができ、新しい疾患メカニズムを同定することができました。
