まず、尖った端を摂氏37.5度で下に向けて加湿卵インキュベーターで受精鶏卵を孵化させます。孵卵の6日目、またはE5に、70%エタノールを噴霧して卵殻を殺菌します。卵キャンドラーを使用して、胚の上の空域の周囲に沿って鉛筆でトレースし、輪郭を描かれた領域を透明なテープで覆います。
胚膜や血管に切り込まずに、湾曲したハサミでトレース領域の周りをそっと切ります。卵殻の上部を捨てます。生理食塩水または細胞培養培地を空域膜に数滴加えて濡らし、簡単に剥離できるようにします。
細かい鉗子を使用して、胚の上に空域膜を慎重に突き刺します。それを削除します。胚をすぐに囲む透明な羊膜をつかんで頭を配置し、ガラスマイクロピペットと空気圧PicoPumpを使用して、5マイクロリットルの適切な細胞培養培地で約50, 000個の細胞を視蓋に注入します。
胚の上にアンピシリン1ミリリットルあたり50ミリグラムを数滴加え、卵の上の穴を透明なテープで覆います。解剖のためにE15まで加湿卵インキュベーターにそれらを置きます。膠芽腫、GBM幹細胞、またはE15で緑色蛍光タンパク質を発現するGSCの注射後にin vivoでE5視蓋に形成された腫瘍をこの図に示します。
GSCは心室表面に付着し、脳壁に浸潤性腫瘍を形成します。この実験では、緑色のGSC、白い核、白い血管、青いインテグリンα-6、および赤色のSOX2または赤色のネスチンの4つの特徴を識別するために使用されました。これらの図は、GSCが血管内に存在し、血管に沿って移動しているように見えることを示しています。
ここでは、in vivo GSC腫瘍の固定および免疫染色されたスライスに回転する3Dボリュームレンダリングの動画を示します。
