卵キャンドラーを使用して、E14またはE15胚の上のエアポケットの周囲を鉛筆でトレースし、輪郭を描かれた領域を透明なテープで覆います。湾曲したハサミまたは細かいはさみを使用して、トレースされた領域の周りをそっと切ります。胚膜や血管に切り込まないように注意してください。
次に、シェルの一番上の部分を破棄します。ひよこ胚を断頭した後、冷たい滅菌CMF溶液を入れた10センチの皿に頭を置きます。滅菌済みの細かい鉗子を使用して、脳を覆っている皮膚を剥がして、下にある硬膜を明らかにします。
脳の左右にある形成中の頭蓋骨を取り除きます。形成する頭蓋骨はまだ脳の大部分を覆っていません。細かい先のとがった鉗子をそっと使用して髄膜を引き裂き、脳の中心を覆い、両側に剥がして脳を明らかにします。
細かい湾曲した鉗子を使用して、脳を前面の下からすくい上げ、そっと空洞から引き出します。脳を前脳、中脳、または視蓋と小脳の3つの主要部分に解剖します。細かい鉗子を使用して上にある軟膜をテクタから取り除き、解剖した脳領域を氷上の小さな滅菌皿に入れます。
脳を埋め込んでスライスするには、スクープとして湾曲した鉗子で視蓋または前脳領域のいずれかをそっと持ち上げ、滅菌ガーゼでわずかに吸い取って余分な液体を取り除きます。適切なサイズの物体の周りにアルミホイルを形成して、簡単な型を準備します。ここでは、小さな長方形の金属振動組織スライサーブロックがオブジェクトとして使用されています。
滅菌トランスファーピペットを使用し、金型に低溶融アガロースを充填します。脳領域をアガロースにすばやく入れ、氷上で約4〜5分間固化させます。サファイアナイフを使用して、振動ティッシュスライサーの切片を切り取ります。
滅菌ヘラを使用して、スライスをすくい上げてトレイから取り出します。別の滅菌ヘラを使用して、セクションをスパチュラからメンブレンインサートにそっとスライドさせます。脳スライスの6ウェルプレートを、摂氏37度と5%二酸化炭素の細胞培養インキュベーター内の膜インサートに置きます。
めっきの翌日に、滅菌パスツールピペットを使用してインサートの下から培地を吸引し、メンブレンインサートの下の各ウェルに1ミリリットルの新鮮なスライス培地を加えます。次に、GBM細胞を脳スライスに導入するために、5マイクロリットルに設定された20マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、培養皿から1〜数個のスフェロイドを取り除きます。スフェロイドを含む培地を目的の脳スライスに静かに排出し、スフェロイドをスライス上で2〜5日間培養します。
培養1週間後のx生体内視蓋スライスの生存率結果をこの図に示す。ビスベンズイミドで核を染色し、ラミニンで免疫染色した脳スライスの共焦点画像は、さまざまな構成で光学的に切片化された正常および無傷の血管を明確に示しています。SOX2転写因子および全核についてビスベンズイミドで染色した脳スライスの共焦点Zスタックの最大投影像をここに示す。
これらの結果は、ニワトリ胚脳スライスを膜インサート上で約2週間培養し、正常な血管および転写因子発現で生存可能であることを示唆している。
