Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

安楽死させたマウスの眼球を摘出し、方向付けのために側頭側に印をつける。前房を取り外します。次に、水晶体と硝子体を取り除き、アイカップをパラホルムアルデヒドに30分間入れます。

アイカップをPBSで30分間洗浄します。溶液を3回交換します。その後、0.5%Triton X-100で30分間洗浄します。

アイカップをブロッキングバッファー中で室温で2時間インキュベートします。免疫染色後、顕微鏡を使用してアイカップから網膜を分離します。網膜を4枚の葉に分け、網膜神経節細胞層を上に向けて平らに取り付けます。

側頭側のマークがオリエンテーションのために取り付けられたままであることを確認します。網膜を封入剤で覆います。カバースリップを配置します。

そして、マニキュアを使用してスライドを密封します。共焦点顕微鏡の電源を入れ、Locate(位置特定)モードで、接眼レンズを使用して関心領域を見つけます。取得モードに切り替えて、網膜全体をカバーするタイルと、情報のすべてのレイヤーのZスタックスライスを設定します。

網膜全体に少なくとも25個のタイルを画像化して、総ボリュームを実現します。Z-Stackスライスを投影して、2次元の面上共焦点顕微鏡画像を生成します。OCTファイバーグラムの複合vis-OCTは、RGC軸索のTuJ1で免疫染色されたフラットマウント網膜の対応する共焦点画像と比較されます。

血管は、共焦点画像上のICAM-2標識血管と一致する識別可能な分岐構造を示します。ex vivo共焦点顕微鏡とin vivo vs-OCTを並べて比較したところ、同一のRGC軸索束ネットワークと周囲の網膜血管系が明らかになりました。