ツァイス共焦点システムの使用について、国立眼科研究所(NEI)の組織学コアに感謝します。この作業は、NEI IRP基金(助成金番号ZIA EY000533-04)によって支援されました。

網膜変性症のモデリングと解析

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. 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C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

開示なし。

このプロトコルは、変性眼疾患の単一遺伝子および多遺伝子 のin vitro 疾患モデルにおいて脂質沈着を効率的に標識、画像化、および定量する方法を提供します。AIベースのソフトウェアであるLipidUNetは、APOE、ナイルレッド、およびBODIPYの3つの一般的な脂質マーカーに適用でき、定量を標準的かつ偏りのない高速自動分析方法を提供します。
LipidUNetの主な制限は、AIのトレーニングデータセットが96ウェルプレートで培養された細胞の40倍の倍率画像に制限されていたという事実です。トレーニング画像セットの結果として、LipidUNetは、現在の形式では、40倍の倍率画像の分析に限定されます。このソフトウェアは、96ウェルプレート以外の他の培養表面で培養された細胞の40倍の画像を分析するために使用できますが、ソフトウェアによる正確な閾値を検証するために、生成された出力マスクを調べるように注意する必要があります。分析できるサンプル/画像の範囲を拡大するには、より多くの画像セット(異なる倍率)が必要になります。
プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。脂質マーカーステップでは、ユーザーは選択した標識化合物(BODIPY、APOE、ナイルレッド)がサンプルを効果的に標識したことを確認する必要があります。成熟RPE細胞は色素沈着が強いことが多く、抗体免疫染色の蛍光シグナルを損なう可能性があります。蛍光シグナルが弱い場合やバックグラウンド染色が多すぎる場合、LipidUNetは脂肪滴を正確に識別できません。同様の理由から、プロトコルの自動イメージングステップに対して適切に選択された取得設定を使用する必要があります。取得した画像の品質が低い場合、LipidUNetは画像を適切にマスクするのに苦労するため、定量化は不正確になります(図6A-L)。最後に、LipidUNetにはソフトウェアが機能するための特定の要件があるため、画像の後処理は重要なステップです。
手動閾値を使用する脂質分析のワークフロー、またはフィジーのようなソフトウェアで自動閾値化を含む技術と比較すると、LipidUNetは、脂質粒子の同定における小さなエラー率に反映されるように、可変脂質沈着を伴う画像全体で非バイアスで信頼性の高いセグメンテーションを提供します(図7)。このソフトウェアでは、追加のトレーニング画像をユーザーが入力できるため、プロトコルで概説されているように、40倍の倍率の対物レンズを利用する画像セットや、異なる脂質マーカーを利用する画像セットの解析も可能です。将来的には、脂質沈着量の定量化が可能になるように、3D画像を解析するようにソフトウェアをトレーニングする予定です。脂質沈着を病態の主な原因とする変性眼疾患が蔓延しており、高齢者人口の拡大に伴い症例が増加すると予測されています13。このプロトコルで概説したように、正確な疾患モデルと効率的な分析ツールは、新しい治療介入の開発を可能にします。

網膜色素上皮(RPE)は、網膜光受容体に隣接する眼の後ろに位置する細胞の単層です。RPEは、光受容体に代謝的および構造的サポートを提供することにより、適切な視力を維持する上で重要な役割を果たします。健康なRPE細胞は、明確な六方晶形態によって特徴付けられる。それらはタイトジャンクションによって接続されており、RPEはその基底側に位置する絨毛毛細血管と頂端に位置する光受容体との間の障壁として作用することを可能にする。網膜生態系を維持するために、RPEは、RPE1におけるグルコース消費を最小限に抑える方法で、主要な代謝産物、例えばグルコースを光受容体にシャトルする。この制限により、RPEは、β酸化によってケトンに変換する脂肪酸を含む、代謝ニーズを維持するために他の代謝物に依存しています2。視細胞外帯(POS)消化からリサイクルされる可能性が高い脂肪酸をエネルギー源として利用するRPEの傾向を考えると、RPEの脂質処理経路の有害な変化は、単遺伝子性および多遺伝子性変性網膜疾患の両方につながるか、関与することがよくあります3。
RPE変性を引き起こす多遺伝子性変性眼疾患である加齢黄斑変性症(AMD)も、RPE単層における異常なオートファジーおよび脂質代謝に関連しています。機能不全のRPE単層がPOSを処理し、他の重要な機能を実行できないと、RPEとブルッフ膜の間に位置する基底線形沈着物(BLinD)と呼ばれる細胞外(サブRPE)沈着物が発生します-AMD病理の特徴です。BLinDの主成分にはリポタンパク質が含まれ、その中で最も豊富なのはアポリポタンパク質E(APOE)4です。BLinDの薄層の蓄積は、AMD 5,6の臨床症状として認識されている柔らかいドルーセンにつながる可能性があります。
いくつかのグループは、RPE機能障害を引き起こす幹細胞由来のin vitro疾患モデルがサブRPE脂質蓄積を特徴とすることを示しています7、8、9。Hallam et al. (2017)は、CFH遺伝子の多型によりAMDのリスクが高い患者から人工多能性幹細胞由来RPE(iRPE)を生成しました。iRPEはAPOEでマークされるようにドルーゼン蓄積を示し、高リスクRPEは低リスク患者から生成されたiRPEよりも大きな沈着物を蓄積しました10。
脂肪滴やドルーゼン沈着などのAMDの細胞の特徴を再現する in vitro モデルを作成するために、患者の血液サンプルから生成されたiRPEラインを、以前に公開された発達ガイドプロトコル11を使用して確立しました。iRPEは、AMDの考えられる原因の1つである代替補体シグナル伝達の増加を模倣するアナフィラトキシンを含む溶液である補体コンピテントヒト血清(CC-HS)に供されました8。得られた脂質沈着物の細胞内沈着を、一般的に使用される脂質およびリポタンパク質マーカー、APOE、ナイルレッド、およびBODIPYを用いて測定した。これらのマーカーを通じて、CC-HSを介した活性化補体シグナル伝達がiRPE細胞8における脂質蓄積を悪化させることが示された。
単遺伝子網膜変性疾患の疾患モデルを開発するために、RPEの ABCA4 遺伝子の変異によって引き起こされる疾患であるスターガルト病の患者からiRPE株を開発しました。 ABCA4 がノックアウトされると、高レベルのリン脂質と光依存性脂質過酸化生成物を含むことが知られている細胞内沈着物であるA2EリポフスチンがRPE12の内部に蓄積することが以前に示されています。 ABCA4 ノックアウトラインは患者ラインと一緒に開発され、両方ともPOS給餌を受けました。Stargardt iRPEは、POS食作用誘発病理を示し、BODIPY染色によって定量化された脂質蓄積の増加を示しました。 ABCA4 KO由来のRPEをCC-HS処理した。BODIPYシグナルの定量化は、同様にスターガルト病モデルにおける脂質取り扱いの欠陥を示した9。
これらの疾患の有病率と効果的な治療法の必要性を考えると、上記の関連する疾患モデルとともに、潜在的な治療法の有効性を定量化するための堅牢な方法を確立する必要があります。客観的、自動化、標準化された方法で脂質沈着を定量するために、機械学習ベースのソフトウェアであるLipidUNetが作成され、マスク分析ツールと組み合わせると、一般的なマーカーであるNile Red、BODIPY、およびAPOEを使用して脂質沈着を迅速かつ効果的に識別できます。この分析パイプラインを使用して得られた要約統計量は、分析してグラフィカルに表示することができ、治療条件の比較が容易になります。プロトコルの回路図を 図1に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概略図:RPE細胞を96ウェルプレート上で増殖させ、活性ヒト血清または精製ウシ外側セグメントでチャレンジして、in vitroでさまざまな種類の網膜変性をモデル化します。RPE細胞は、ナイルレッド、ボディピー、およびAPOEでリポタンパク質沈着物について固定および染色されます。共焦点顕微鏡を使用して、蛍光標識された脂質粒子のZスタックを取得し、その後、2D最大強度投影に加工します。機械学習アルゴリズムは、リポタンパク質粒子を認識して正しくセグメント化するようにトレーニングされました。粒子数とさまざまな形状メトリックを含むサマリーテーブルが生成され、その後のプロットと統計分析に使用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

網膜色素上皮(RPE)は、目の後ろにある六角形の細胞の単層です。光受容体と脈絡膜毛細血管に栄養とサポートを提供し、光受容体外側セグメント(POS)の食作用を行い、外網膜の恒常性を維持するために二極的にサイトカインを分泌します。突然変異、加齢、環境要因によって引き起こされる機能不全のRPEは、他の網膜層の変性をもたらし、視力喪失を引き起こします。変性RPEの特徴的な表現型の特徴は、細胞内および細胞内の脂質リッチ沈着物です。これらの沈着物は、さまざまな網膜変性疾患に共通の表現型です。単遺伝子網膜変性の脂質沈着表現型を in vitroで再現するために、患者の線維芽細胞から人工多能性幹細胞由来RPE(iRPE)を作製した。Stargardtおよび遅発性網膜変性症(L-ORD)の患者から作製した細胞株にPOSを7日間与えて、RPE生理機能を再現し、これらの疾患でPOS食作用誘発病理を引き起こしました。代替補体活性化に関連する多遺伝子性疾患である加齢黄斑変性症(AMD)のモデルを生成するために、iRPEは代替補体アナフィラトキシンで挑戦されました。細胞内および細胞内脂質沈着物は、ナイルレッド、ホウ素ジピロメテン(BODIPY)、およびアポリポタンパク質E(APOE)を使用して特徴付けられました。脂質沈着物の密度を定量化するために、機械学習ベースのソフトウェアであるLipidUNetが開発されました。このソフトウェアは、培養表面上のiRPEの最大強度投影画像でトレーニングされました。将来的には、3次元(3D)画像を解析し、脂肪滴の体積を定量化するように訓練される予定です。LipidUNetソフトウェアは、疾患モデルにおける脂質蓄積を減少させる薬剤を発見するための貴重なリソースとなるでしょう。

このプロトコルは、ナイルレッド、ボディピー、およびAPOEによって染色された脂質沈着物を特定するためのワークフローを提供します。開発されたソフトウェアは、脂質沈着物を自動的に識別して定量することができ、概説されたプロトコルが最適化されたときに最高のパフォーマンスを発揮します。細胞モデルの品質は適切な画像セグメンテーションの品質に大きく影響するため、分化に成功したRPE(図3A)と低分化したRPE(図3B)の例が含まれています。
プロトコルに記載されている3つのマーカーのうち2つ、ナイルレッドとボディピーは、蛍光画像ではっきりと明るい小さな円形のポイントとして識別されます(図5および図6)。プロトコルからの「ポジティブ」画像は、これらの異なる堆積物の適切な識別です(図5A-Dおよび図5E-H)。「ネガティブ」の結果は、弱い染色(図6A-Cおよび図6D-F)または高いバックグラウンド強度(図6G-I)のいずれかのために、バックグラウンド蛍光を堆積物と間違えることにより、画像の誤ったセグメンテーションを示します。
APOE鉱床にはさまざまなサイズと形状があり、ナイルレッドやボディピーの円形の堆積物ではなく、より楕円形または不規則に見えます。これらの堆積物はまた、点状が少なく、サンプルの透過性の変動により、信号強度が堆積物間で異なる可能性があります。正しい識別は、飽和度の低いものを含む各鉱床を識別しますが(図5I-L)、誤ったセグメンテーションはこれらの鉱床を拾いません(図6J-L)。したがって、急激なばらつきを避けるために、染色およびイメージング方法を最適化することが重要です。これを行う1つの方法は、免疫染色中にサンプルの透過処理ステップに注意を払うことです。蛍光シグナルを最適化するために、APOEの固定および免疫染色の前に細胞を溶解することができ、その結果、APOE沈着物の均一な飽和とより良いセグメンテーションが得られます。
96ウェルプレート以外の培養プラットフォームで成熟した細胞のセグメント化された画像も提供される。LipidUNetソフトウェアは、トランスウェルで培養された細胞の画像で実行され、脂質沈着物が閾値化される一方で、トランスウェル膜の細孔も閾値化されます(図6M-O)。形状とサイズが類似しているため、現在の形のLipidUNetソフトウェアは、脂質沈着物とトランスウェル孔の両方を無差別にマスクします。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> 図5:代表的な結果。 (A、E、I)96ウェルメッキRPEは、ヘキスト核染色(青)およびナイルレッド(マゼンタ)、ボディピー(緑)、またはAPOE(オレンジ)のいずれかで染色され、Zスタックの最大強度投影です。(B,F,J)画像処理後のLipidUNetソフトウェアのグレースケール入力画像。(C,G,K)すべての堆積物が正しく識別されるLipidUNetによって生成されたマスク。(D,H,L)マスクされた各パーティクルのアウトラインには番号が付けられます。これらのラベルを使用すると、画像内の各粒子を生データを含むスプレッドのエントリに接続できます。(A-D)はナイルレッド染色を示しており、ソフトウェアは弱い信号にもかかわらずバックグラウンドに対する堆積物を正確に認識することができます。(E-H)は、BODIPY信号とバックグラウンドの間に強いコントラストを示し、これは理想的です。LipidUNetは、画像内のすべての堆積物を正しく識別します。(I-L)は強いAPOEシグナルを示し、この染色でよく見られるシグナル飽和の変動性を表します。それにもかかわらず、画像セグメンテーションは各APOEデポジットの境界を識別することができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> 図6:最適ではない結果。 (A、D、G、J、M)96ウェルメッキRPEは、ヘキスト核染色(青)およびナイルレッド(マゼンタ)、ボディピー(緑)、またはAPOE(オレンジ)のいずれかで染色され、Zスタックの最大強度投影です。(B,E,H,K,N)画像処理後のLipidUNetソフトウェアのグレースケール入力画像。(C,F,I,L,O)LipidUNetによって生成されたマスクが正しくありません。赤い円は、ソフトウェアが脂質沈着物を誤って識別した場所を示します。(A-C) ソフトウェアがバックグラウンド染色を堆積物として識別したため、Nile Redの処理が正しくありません。これは、画像にバックグラウンドは高いが脂質沈着物がほとんどない場合に、より頻繁に発生する可能性があります。BODIPY染色の2つの例が示されています:(D-F)弱いBODIPY染色による低品質の画像と(G-I)高いバックグラウンドの強いBODIPYシグナル。どちらの場合も、ソフトウェアは、核を囲む背景の円形リングから小さな円形の脂質沈着物を区別することができません。染色とイメージングはこれらのエラーを回避するために最適化する必要がありますが、最新バージョンのLipidUNetはこれらの画像に対して大幅に改善されています。(J-L)APOEセグメンテーションが正しくありません。堆積物は信号のサイズと飽和度がより可変であるため、ソフトウェアはいくつかの堆積物を認識するのが困難です。(M-O)RPEをトランスウェルに播種し、ナイルレッドで染色した。Zスタックのスライスは、ナイルレッド脂質沈着物とトランスウェル孔の両方とともにここに示されています。ソフトウェアは、トランスウェル孔を含む赤い円とナイルレッド鉱床を指す緑色の矢印で示されているように、2つを区別できません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> 図7:マスクツールの比較 。 (A、B、C)脂質沈着量が変動する96ウェルメッキRPEは、ナイルレッド(赤)で識別されます。画像は、最大検索、最大エントロピー、およびRenyiエントロピーの3つの異なる一般的なマスク方法を使用してマスクされ、LipidUNetで生成されたマスクと比較されます。元の画像には脂質沈着物の手動カウントが添付され、マスクには各セグメンテーション方法による予測カウントが表示されます。平均エラー率は、次の式を使用してセグメンテーションの各方法について計算されました:mean[(|予測カウント - 手動カウント|/手動カウント) x 100]。LipidUNetで生成されたマスクは、他のマスキング方法と比較して、沈着が変動する画像全体で脂質沈着をより正確に識別します(平均エラー率:23%LipidUnet、1164%Find Maxima、851%最大エントロピー、203%Renyiエントロピー)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コンポーネント</td>
			<td>猫番号</td>
			<td>ストックコンク</td>
			<td>最終コンク</td>
			<td>ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>MEM アルファ</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>該当なし</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>N2サプリメント</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>該当なし</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>熱不活性化FBS</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>該当なし</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10ミリメートル</td>
			<td>0.01ミリメートル</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100ミリメートル</td>
			<td>1ミリメートル</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/mL</td>
			<td>100U/mL</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>タウリン</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50ミリグラム/ミリリットル</td>
			<td>250グラム/ミリリットル</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18.1ミリグラム/L</td>
			<td>20ug / L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug / L</td>
			<td>0.013ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">総容量、mL</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>表1:RPE-MM試薬組成。 RPE-MMの試薬と最適濃度のリスト。

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著者スポットライト:加齢性黄斑変性の病因を解明し、潜在的な治療法を発見する 

眼の網膜色素上皮層に影響を及ぼす変性眼疾患は、単一遺伝子および多遺伝子起源を有する。いくつかの疾患モデルとソフトウェアアプリケーションであるLipidUNetは、疾患のメカニズムと潜在的な治療介入を研究するために開発されました。

LipidUNet-機械学習に基づくiPS細胞由来網膜色素上皮を用いた脂質沈着物のキャラクタリゼーション・定量法

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

本研究では、加齢に伴うマクロ変性の病態解明と治療法の発見を目指します。脂質滴分析用のこの半自動パイプラインは、代謝および老化疾患を研究するための堅牢なシステムを提供します。私たちの研究室では、脂質沈着物の蓄積を減らすことを目的とした遺伝子スクリーニングまたは低分子スクリーニングのいずれかを使用して、AMDの治療のための創薬標的を見つけることに焦点を当てています。

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

2.6K ビュー.  National Institutes of Health (NIH). 本研究では、加齢に伴うマクロ変性の病態解明と治療法の発見を目指します。脂質滴分析用のこの半自動パイプラインは、代謝および老化疾患を研究するための堅牢なシステムを提供します。私たちの研究室では、脂質沈着物の蓄積を減らすことを目的とした遺伝子スクリーニングまたは低分子スクリーニングのいずれかを使用して、AMDの治療のための創薬標的を見つ?...

ビデオ: 著者スポットライト:加齢性黄斑変性の病因を解明し、潜在的な治療法を発見する 

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

生物学

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

ニトロレダクターゼ/メトロニダゾール媒介アブレーションとゼブラフィッシュ網膜色素上皮の再生を研究するためのMATLABプラットフォーム(RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

組織学的分析のためのヒトの眼からの網膜色素上皮/脈絡膜フラットマウントの効率的かつ一貫した生成

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

レチナール色素上皮食作用とリポフスチン蓄積の定量化

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

著者スポットライト:高度に分極したヒト網膜色素上皮培養における改良されたリポフスチンモデルと外側セグメント食作用能力の定量化  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...