まず、ナイルレッド粉末をアセトンに3ミリグラム/ミリリットルの濃度で溶解します。溶液を室温で15分間インキュベートし、定期的に混合します。0.22マイクロメートルのフィルターを使用して、溶液中に残っている沈殿物の量に応じて、溶液を1回または2回ろ過します。
次に、原液をDPBSで1対500の比率に希釈して作業溶液を調製します。パラホルムアルデヒド固定RPE細胞に200マイクロリットルの作業溶液を加え、光から保護するシェーカー上で室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをDPBSで2回洗浄し、200マイクロリットルのDPBSを加え、摂氏4度で保存します。
BODIPY染色では、BODIPYを無水DMSOに溶解して3.8mmモルのストック濃度を調製します。次に、原液をDPBSで1対300の比率に希釈して作業溶液を調製します。パラホルムアルデヒド固定RPE細胞にBODIPYの作業溶液200マイクロリットルを加え、ロッカー上で室温で一晩インキュベートします。
翌日、細胞をDPBSで2回洗浄し、200マイクロリットルのDPBSを加えてから摂氏4度で保存します。APOE免疫染色では、DPBSを1%BSA、0.5%Tween 20、および0.5%Triton X-100と組み合わせて緩衝液を調製します。パラホルムアルデヒド固定RPE細胞を200マイクロリットルの緩衝液中で1時間ブロックし、透過処理します。
インキュベーション後、緩衝液中で1対100に希釈したAPPLE一次抗体を添加し、室温で一晩インキュベートします。翌日、サンプルをDPBSで2回洗浄します。次に、1〜1000に希釈した200マイクロリットルの二次抗体溶液を室温で1時間加えます。
インキュベーション後、細胞をDPBSで2回洗浄し、200マイクロリットルのDPBSを加えてから摂氏4度で保存します。
