RPE関連障害は、依然として疾患の混合の主要な部分を占めていますが、RPE関連障害の生理学的および病理学的研究の優れたモデルとして役立つ初代RPE細胞の仮想培養における効果的な残骸はありません。このプロトコルでは、初代IPCを培養するためのわかりやすいプロトコルを提供し、後のRP特性を迅速に回復および維持することができ、この方法を使用することにより、人々はマシステート研究および保護薬物スクリーニングからRP細胞を迅速に生成でき、RPE障害の新しい治療法の開発を促進することができると考えています。段階的な価値のデモンストレーションにより、RP細胞を研究したいさまざまなラボでこの方法を再現するのがはるかに簡単になります。
組織消化酵素マラクアドの解凍を開始し、1X PBSを滅菌します。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターユニットを通して溶液をろ過することにより、2%ペニシリンと2%ストレプトマイシンを補給します。培養プレートとトランスウェルインサートのウェルを1X PBSで洗浄します。
PBSをウェルから取り出し、ピペットでトランスウェルし、1ミリリットルの新鮮な1X PBSを下チャンバに加え、600マイクロリットルの10マイクログラム/ミリリットルのラミニン溶液を上部チャンバに加えます。プレートとトランスウェルインサートをこのヘリシカルチャーインキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。その後、ラミネート溶液を上部チャンバーから取り出し、1ミリリットルの冷たい1X PBSで2回洗浄してから、セルを装着します75%エタノールとUV光でラミネートフローフードを清掃します。
約25ミリリットルの75%エタノールを含む50ミリリットルの滅菌遠心分離管3本、約25ミリリットルの1X PBSを含む50ミリリットルの滅菌遠心分離管3本、および約15ミリリットルの1X PBSを含む3つの10センチメートル滅菌細胞培養皿を準備します。10センチのペトリ皿に約15ミリリットルの75%エタノールに4頭のブタの眼球を浸し、はさみと鉗子を使用して、残っている結合組織と筋肉をすべて切り取ります。眼球を除染するには、75%エタノールで満たされた3つの50ミリリットルの滅菌遠心チューブに4つの眼球を浸して洗浄します。
次に、1X PBSで満たされた3つの50ミリリットルの滅菌遠心チューブで眼球を順番に洗浄します。眼球を完全に洗うために毎分チューブを反転させます。4つの眼球を1X PBSを含む10センチメートルの滅菌細胞培養皿に移します。
各眼球の外面を再度トリミングして、視神経と小さな破片を取り除きます。はさみを使用して、辺縁と強膜の交差点に小さな切り込みを入れます。次に、角膜、虹彩、水晶体、硝子体、神経網膜を取り除きます。
RPE脈絡膜強膜複合体を新しい10センチメートルの細胞培養皿に移し、4つのカットをしてアイカップを平らにし、四つ葉のクローバーの形にします。4つのRPE脈絡膜強膜複合体を新しい10センチメートルの皿に入れ、20ミリリットルの新鮮なトリプシンEDTA溶液を注いでRPE脈絡膜強膜複合体をマージすることにより、EDTA溶液消化のトリップを実行します。皿を摂氏37度の細胞培養インキュベーターにほぼ30分間入れます。
30分後、インキュベーターから皿を取り出し、10%FBSを含む20ミリリットルのプレウォーム細胞培養培地を皿に加えます。EDTA溶液中のトリップを中和するには、5ミリリットルのトランスファーピペットを使用して、数回穏やかにピペッティングしてRPE細胞を解離させます。細胞懸濁液を15ミリリットルの遠沈管に集め、さらに10ミリリットルの新鮮な培養培地をFBSで静かにピペットでピペットで留めて、皿上のRPE脈絡膜強膜複合体を洗浄します。
チューブを300 Gで室温で5分間遠心分離することにより、RPE細胞を収集します。ピペットを使用してスーパーエージェントを吸引し、FBSを含むさらに5ミリリットルの培養培地を加えて細胞を再懸濁します。さらに300 Gで5分間遠心分離します。
スーパーエージェントをデカントし、12ミリリットルの培地で細胞を再懸濁します。次に、ウェルあたり100, 000〜200, 000個の細胞を12ウェル培養プレートまたはトランスウェルインサートに播種します。2日ごとに培地を交換し、細胞がインサートごとにウェルの表面を完全に覆ったら、血清濃度を1%に下げます。
細胞が回収されるまで、2日ごとに培地を交換してください。2日目、6日目、10日目の初代ブタRPE細胞の代表的な画像をここに示します。初代ブタRPE細胞、初代ヒトRPE細胞、ARPE 19細胞およびブタRPE脈絡膜組織におけるシグネチャ遺伝子のmRNAレベルのQRTPCR分析は、このグラフィック画像によって検出されます。
ここでは、GAP DHをRTPCRのハウスキーピング遺伝子として使用しました。初代ブタRPE細胞には4つの生物学的複製が使用され、RPE 19細胞には3つの生物学的複製が初代ヒトRPE細胞およびブタRPE脈絡膜組織に使用された。ARPE 19細胞における遺伝子発現レベルを対照として設定した。
ARPE 19およびブタRPE細胞ならびに初代ヒトRPE細胞およびブタRPE脈絡膜組織におけるRPE 65タンパク質の西洋血液分析をこの図に示す。ビンキュリンはここでローディングコントロールとして使用されました。この図は、1%FBSを含むDMEMベーシック培地中のブタRPE細胞の2週間の培養を示しています。
ラミンの有無にかかわらず培養した細胞をRPE 65、ナトリウムカリウムAPTA、Z01、およびHexで染色しました。ラミニンの有無にかかわらず培養した細胞シートにおけるTR測定値がこの図に描かれている。初代ブタRPEおよびARPE19細胞における血管内皮増殖因子またはVEGFおよび色素上皮由来因子またはPEDFの西部血液分析をこの図に示す。
培養初代ブタRPEおよびARPE 19細胞のセクター機能をこれらの画像に示します。このプロトコルの大部分は、RPEチデグリア複合体からRP細胞を溶解することです。毎回新鮮なトリップと溶液を使用し、消化時間を適切に制御して、8つのRP細胞を溶解することをお勧めします。
