Name: primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
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本研究は、部分的 (DS) に BrightFocus 財団によって賄われていた。

動物を対象とする手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ピッツバーグ大学によって承認されています。
1. ソリューションを準備します。
<ol><li>成長媒体によって補間ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM), 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 mM L-グルタミン 1 x メモリ必須でないアミノ酸と高グルコースを準備します。あらかじめ使用前に 37 ° C の定温器でメディアを温めます。</li>
	<li>2% (重量/巻) 当期 II 作業ソリューションを準備します。<ol>
<li>当期 II 300 μ L HEPES 緩衝生理食塩水 (50 mM HEPES/島 pH 7.4 では、150 mM の NaCl) での 30 mg を溶解して 100 mg/mL dispase II の原液を準備します。このボリュームは、3-4 マウス、スケール アップまたはダウン、実験用マウスの数に基づいてできる)。この株式は、4 ° C で少なくとも 1 週間に保存できます。</li>
		<li>1.2 mL 滅菌 DMEM、高グルコース、0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルタ リングに当期 II 在庫 100 mg/mL の 300 μ L を追加することによって 2% 当期の作業ソリューションを準備します。層流無菌条件の下でキャビネットでこの手順を実行する必要があります。事前準備当期 II で使用する前に 37 ° C の定温器を温めます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウスの目の取得についてください。
<ol><li>すべての承認されたメソッドを使用してマウスを安楽死させるし、吸収パッドの上に置きます。</li>
	<li>手袋、親指と人差し指、目の周りを入れて、proptose 眼球に皮膚を優しくプッシュします。</li>
	<li>皮膚と眼球の間の角度のはさみの先端を挿入し、目を慎重にカットします。汚染を避けるためには、70% エタノールで目を簡単にディップします。</li>
	<li>すぐに目のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ペトリ皿でを配置します。</li>
	<li>2.2 2.4 2 番目の目を削除する手順を繰り返します。</li>
</ol>3. 目の解剖
<ol><li>結合組織を解剖顕微鏡の下で目から慎重に取り外します。これは、PBS または乾いたシャーレのいずれか行うことができます。<ol>
<li>縫合鉗子を使用して、眼球から結合組織を持ち上げて Vannas はさみを使用してそれらをカットします。強膜を切る場合にそのまま後方のアイカップを得ることは事実上不可能だから強膜をカットしないでください。</li>
		<li>結合組織を洗浄した後で、次の PBS で生じる眼球がステップに洗い続けます。 注: すべての次の手順は、層流無菌条件の下でキャビネットに行わなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>予め温めておいた 37 ° C DMEM (高血糖) で 2 回目を洗浄します。慎重に鉗子を使用して予め温めておいた 37 ° C (高血糖) DMEM に眼球を転送します。新しい料理で新鮮な媒体に媒体と転送の眼球を吸引します。</li>
	<li>DMEM (高血糖) 培地を吸引し、37 ° C の定温器で 45 分間に予め温めておいた 2% (重量/巻) 当期 II 使用液で目を孵化させなさい。 注: すべての次の手順で配置、目や成長中の組織を保護し、解剖の良い媒体を提供するアイカップを操作します。</li>
	<li>当期 II ソリューションを削除し、古い培地を吸引し、新しい 37 ° C に予め温めておいた成長培地 (図 1 a) を追加して培地に 2 回目を洗ってください。 注: dispase II による解離後、眼球にソフト。</li>
	<li>鉗子で目を押し又はコナラの周り層流にキャビネットを配置解剖顕微鏡の下で Vannas はさみを使用してそれぞれの目の切開を行います。<ol>
<li>慎重にソリューションに眼球を維持、拡張又はコナラのまわりをカットとカットが完了したら、前方の角膜を引き離し前方の角膜を取り外します。</li>
		<li>優しく teethed 鉗子 (図 1 b、 1 c)、アイカップからそれらを引き出して、水晶体カプセルと関連付けられた虹彩色素上皮を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE から神経網膜の分離を容易にする 37 ° C で 20 分間培地に結果として得られる後部アイカップを孵化させなさい。</li>
	<li>層流にキャビネットを配置解剖顕微鏡の下で 4 花びらに後部のアイカップをカットします。カットは花びらの接続 (図 1 d) を保つために十分に短いが、アイカップを平らにするのに十分な長さであるべきです。<ol>
<li>アイカップを平らにし、残りを保持しながら鉗子で引いて非常に穏やか、神経網膜を削除 (図 1e) 別の鉗子で強膜網膜色素上皮-脈絡膜複合体。引き中心ではなくエッジから開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての四つの組織を 37 ° C に予め温めておいた培地でいっぱい新しい培養皿に転送します。</li>
</ol>4 主な網膜色素上皮細胞の分離
<ol><li>四つの強膜網膜色素上皮-脈絡膜の複合体の 1 つの花びらを保持鉗子を超微粉、解剖顕微鏡顕微鏡クレッセント ナイフを使用して、基になる基底膜 (脈絡膜) からそのまま網膜色素上皮シートをそっとはがします(図 1 階)、層流をキャビネットに配置されます。<ol>
<li>P200 ピペットを使用して、成長培地を含む新しい培養皿に網膜色素上皮シートを転送します。RPE シートを転送する際は、数回ピペッティングによる培地でピペット チップを濡れている組織が先端部に付着するを防ぐために。RPE は脈絡膜から明確に区別される: RPE 見えるより茶色、脈絡膜が暗いと付箋とフワフワになります。</li>
		<li>また、14脈絡膜から網膜色素上皮をデタッチするのに酵素消化と鉗子のない穏やかな解離を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3 回使用して 37 ° C に予め温めておいた RPE シートを洗って滅菌培養皿の成長培地。各洗浄工程後注意深く破片網膜や脈絡膜などの他の組織を避けながら RPE シートを収集します。最後の洗浄の最後に P200 ピペットと RPE シートを収集し、新しい 1.5 mL 遠心チューブにそれらを置きます。 注: RPE シートを遠心分離する必要はありません: 1 min 以内で重力によって堆積してしまいます。</li>
	<li>P200 ピペットを使用して余分な成長媒体を削除します。予め温めておいた新鮮な培地に細胞を再懸濁し、軽く P200 ピペットを使用してそれらのカップを刻んだ。気泡の形成を避けるため。単一細胞懸濁液が最適です、また、あまりにも多くの製粉を避ける、それ以外の場合網膜色素上皮細胞が生き残ることができません。非常に優しく製粉 40 - 50 回をお勧めします。</li>
</ol>5. 網膜色素上皮細胞の培養
<ol><li>細胞培養プレート上にプレートします。<ol>
<li>網膜色素上皮細胞のダウン ストリーム アプリケーションでは、極性の保持を必要とする場合 12 ウェル培養皿にあらかじめ読み込まれている 1 つの 12 mm ポリエステル膜挿入 2 マウスからプレート、RPE の細胞します。その場合に網膜色素上皮細胞は六角形や色素沈着など、元のプロパティを維持することができるため、高密度に細胞をめっきが望まれます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートを移動しない、または最初の 72 時間培養の成長媒体を変更します。3 日後、古い媒体を予め温めておいた、新鮮な成長媒体に置き換えます。その後一日おきに培養培地を変更します。網膜色素上皮細胞が合流に得れば、培地に FBS を 2% に削減します。 注: セルは、0.25% トリプシンを使用して分割することができます。ただし、分割後は、セルは、六角形の形状とその後通路で色素沈着に失う可能性があります。我々 は、セルの分割はお勧めしませんが、文化の下流のアプリケーションで必要とされる場合一次電池できません無期限に継代すること注意してください: 5-7 通路後解除区別するために知られています。</li>
</ol>

<ol>
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DS は、バイエル ヘルスケア社、ドイツ、f ・ ホフマン ・ ラ ・ ロシュ、スイス連邦共和国からの資金の研究を受けています。残りの著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。この作品は、失明の防止 (ピッツバーグ大学ウィルマー眼研究所に制限されていない補助金) に研究によってサポートされます。 この仕事は、眼科、ピッツバーグ大学から DS にスタートアップ資金に支えられています。

提示された詳細なプロトコルは、マウス初代 RPE 培養 1 週間後の confluency に到達、六角形、2 週間後に色素沈着など主な RPE 特性の信頼性確立をできます。得られた網膜色素上皮細胞は、ビタミン A 代謝9、視細胞外側セグメント10の貪食能およびイオン輸送11、上皮細胞極性2、ライソゾームなどの下流のアプリケーション?...

網膜色素上皮 (RPE) は、神経網膜と眼の脈絡膜の間にある偏光上皮細胞の単一の層です。網膜色素上皮細胞の機能と網膜色素上皮の膜の整合性、ビジョンの重要な RPE 外側血液網膜関門、水と網膜の間のイオンの輸送の管理などの複数のプロセスで主要な役割を果たしているので、脈絡膜、光吸収、酸化ストレス、レチノイド代謝の制御と光受容体1,2の外側のセグメントの貪食作用から保護します。硝子体液を血液から渡すから全身投与薬を防ぐバリアー機能と同様に、目の後ろに RPE の場所で、RPE 関数は、生体内の複雑性を研究することが難しくなっています。したがって、柔軟な制御環境3,4の網膜色素上皮細胞を研究する RPE 細胞培養の確立のための大きい必要があります。
取得し、セルを格納する簡単で便利な方法を提供する確立された RPE 細胞の数が存在します。しかし、継代細胞初代培養細胞2,3,4と比較していくつかの欠点があります。まず、彼らはしばしば、細胞形態の変化によって特徴付けられます。たとえば、既存の細胞のどれも細胞極性表現型の損失とタイトな接合4の部分的な消失により網膜色素上皮のバリア性の信頼性の高い研究に適していること発見されました。極性と適切な細胞間の接続の損失に加えて網膜色素上皮細胞はすぐにアダルト RPE5キー メラニン合成酵素の不在のために色素沈着を失います。色素沈着を復元することができます、しかし、透過型電子顕微鏡の組み合わせを含んでいる再色素沈着のメカニズムの包括的な分析、メラニンの存在を確認する遺伝子表現の分析と化学試金は決して実行される6をされて。1 つ以上の制限は RPE 細胞拡張セル寿命 (時に - 不滅)、特定の条件下で基板と植民地7,をフローティング フォームからデタッチ自己更新の多能性幹細胞に変形できます。8します。 この制限は移植実験3のセルの行を使用することは不可能になります。
確立された RPE 細胞の短所を考慮して新鮮な組織から得られる主な RPE 細胞培養は RPE を勉強するより生物学的に関連するモデルとして役立つかもしれない。など基本の細胞生物学の研究にもビタミン A 代謝9、貪食受容外側セグメント10とイオンの輸送11の RPE に固有の機能を学習するだけでなく、プライマリの網膜色素上皮細胞が使用されている上皮細胞極性2 、ライソゾームの恒常性とオートファジー12,13。
RPE の初代培養の確立に関する出版物の数がずっとある年の最後のカップルで研究3,14,15のこの分野での関心の高まりを示します。人間の網膜色素上皮細胞、ウシおよびブタの網膜色素上皮細胞などの非人間の網膜色素上皮細胞の多数のプロトコルが公開された16,17,18,19。しかし、はるかに小さいサイズのためマウス網膜色素上皮細胞を処理するより困難です。なしの網膜色素上皮細胞を分離するために苦労している多くの研究者はまだにもかかわらず、出版物のかなりの数は、マウス14,20,21から網膜色素上皮細胞を分離するためのプロトコルを記述して、脈絡膜細胞または神経網膜の残骸からのセルの汚染。ここでプライマリ マウス網膜色素上皮細胞培養、マウス、目の解剖および培養細胞を生成する RPE シートの分離から目の取得などを確立するためのプロトコルを提案する.このビデオ プロトコル マウス初代 RPE 培養し解離手法に関するガイダンスを必要とし始めている者に特に有用であります。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;animals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3-week old wildtype mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antibody</td><td>A gift from Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Phalloidin&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Polyclonal Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;instruments and equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator with hot air sterilization</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &amp;micro;m, Sterile</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td><td>STEPHENS instruments</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Crescent straight knife</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors, 8 cm, 45&amp;deg; Angle, Standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Laboratory Microscope&amp;nbsp;Leica DM IL LED</td><td>&amp;nbsp;Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier and non-filtered pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

網膜色素上皮 (RPE) は、神経網膜と眼の脈絡膜の間にある高い偏光多機能上皮です。六角にパックされ、タイトな接合で接続されている色素細胞の単一のシートです。RPE の主な機能には、視覚サイクル ライト、小屋視細胞外側セグメントの貪食能、イオンの空間バッファリング、栄養素、イオン水と積極的な関与の輸送の吸収があります。このような重要かつ多様な機能を持つ網膜色素上皮細胞の生物学を研究する重要です。RPE 細胞の数が確立しています。しかし、すぐに自然の網膜色素上皮細胞の形態学的および生理学的な特性のいくつかを失う継代と不死化細胞が知られています。したがって、一次電池は RPE 細胞生物学と機能のさまざまな側面を勉強に適しています。マウス培養網膜色素上皮細胞は研究者に非常に有用なのでマウス モデルは、生物学研究で広く使用されて、しかしマウスから細胞の RPE の収集もその小さなサイズのために非常に挑戦です。ここでは、眼球摘出と目の郭清と培養細胞を生成する RPE シートの分離を含むプライマリ マウス網膜色素上皮細胞の培養を確立するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、効率的な細胞回復をできます。2 つのマウスから得られた網膜色素上皮細胞は文化の真正な RPE の元のプロパティのいくつかは六角形と 2 つの後の色素沈着など細胞の表示 1 週間後培養プレートにあらかじめロード 1 つ 12 mm ポリエステル膜挿入時の密度に達することができます。文化週間。

マウス プライマリ RPE 文化文化で 1 週間後 12 mm ポリエステル膜挿入に達する 90-95% の confluency に 2 マウスから設立されました。文化の 2 週間後のセルは 100% の confluency に達して、六角形、色素、および bi 核細胞のモザイクを形成し始めた。培養、細胞形状と色素沈着、形成を続けて 3 週間でしかし、4 週間後に細胞の部分得た沈着 (図 2)。
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Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

網膜色素上皮 (RPE) は目の多機能上皮です。ここでマウスの網膜色素上皮から派生した一次電池文化を確立するためのプロトコルを提案する.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

21.0K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. 網膜色素上皮 (RPE) は目の多機能上皮です。ここでマウスの網膜色素上皮から派生した一次電池文化を確立するためのプロトコルを提案する.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

神経科学

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

生物学

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

培養初代マウスRPEの特性評価と形態学的ダイナミクス

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

著者スポットライト:網膜症研究のための成体マウスからの一次網膜色素上皮細胞の効率的な単離

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

要約

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網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

マウスの眼から網膜幹細胞の単離

無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

モルモットの目からの網膜色素上皮細胞の分離