このプロトコルでは、初代マウス網膜色素性上皮細胞を単離するための簡単で効率的な方法を概説します。網膜色素上皮細胞は、視細胞を維持し、網膜の正常な機能を確保するために非常に重要な役割を果たしています。当研究室では、初代マウス色素上皮細胞を、網膜外関門や加齢黄斑変性症などの関連疾患を研究するための重要なツールとして分離しています。
マウスの目を抽出するには、施設の承認された方法に従ってマウスを倫理的に安楽死させ、マウスを滅菌アンダーパッドに置き、眼窩領域の5/45スタイルのピンセットを押して眼球を核形成してプロプトーシスを誘発し、ピンセットを目の後部に移動し、視神経がまだ無傷であることを確認するためにゆっくりと引っ張って目を取り除きます。鉗子を使用しながら、5%ポビドンヨウ素を含む2ミリリットルの微量遠心チューブに目を浸します。室温で2〜3分間目をインキュベートします。
ポビドンヨードから目を取り除き、ペトリ皿に入れます。滅菌トランスファーピペットを使用しながら、ポビドンヨードのオレンジ色がなくなるまでハンクスのバランス生理食塩水で目を洗います。これには約2〜3回の洗浄が必要です。
目を新しいペトリ皿に入れ、冷たい完全なRPE細胞増殖培地に浸します。そこから、解剖顕微鏡で解剖を開始できます。顕微鏡下で、ピンセットおよび/またはバンナスハサミを使用して、外眼筋の結合組織を引き抜くか切り取ります。
その後、冷たいRPE細胞培養培地で1時間目を保持することができます。ただし、眼球を洗浄した後はそのまま次のステップに進むことが好ましい。酵素A溶液を入れた2ミリリットルの微量遠心チューブに目を移し、インキュベーター内で摂氏37度で40分間インキュベートします。
酵素A溶液から目を取り除き、酵素B溶液を入れた新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに入れ、インキュベーター内に置き、摂氏37度で50分間インキュベートします。酵素Bから目を取り除き、60ミリメートルのペトリ皿に入れて水没させ、RPE細胞増殖培地を完成させてから、摂氏4度で30分間インキュベートします。皿を解剖顕微鏡の下に置き、解剖を開始します。
M5S鉗子と注射器の針を使用して、オラセラッタセクションを切開します。次に、2つの鉗子で、1つの鉗子で切開の内側部分をつかみ、もう一方の鉗子で角膜をつかみます。角膜を引っ張って網膜から角膜をゆっくりと引き裂き始めます。
角膜を取り除くときは、必ず少しずつ裂き、裂け目を下に移動します。これにより、RPEはほとんど無傷のままになり、よりきれいな裂け目が得られます。角膜が完全に剥離すると、虹彩と水晶体が見えるはずです。
アイソレーションの純度を維持するために、鉗子で虹彩とレンズの両方を取り外します。RPE層から神経網膜を除去するには、1つのピンセットでアイカップの外層をつかみ、RPE層と神経層の両方の間に2番目のピンセットのアームを配置します。そこから、神経網膜をRPE層からそっと引っ張るかすくい取り、神経網膜を捨てます。
RPEレイヤーを破片のない皿の別の場所に移動します。脈絡膜と強膜からRPEを分離するには、5/45スタイルのピンセットでアイカップの内側をそっとこすり、RPE細胞を確実に分離します。RPE細胞は、懸濁すると白濁して見え、RPE細胞増殖培地を完成させます。
3.2ミリリットルの滅菌トランスファーピペットを使用して細胞を吸引し、完全なRPE細胞増殖培地を含む新しい15ミリリットルの遠沈管に移します。細胞は、室温で300gで10分間遠心分離することができる。その後、上清を吸引し、加温したRPE細胞増殖培地にペレットを再懸濁します。
細胞を100ミリメートルのペトリ皿にプレートし、摂氏37度と5%CO2でインキュベートします。これらの画像は、継代0および継代1での単離の成功を示しており、これはRPE細胞の色素沈着によって明らかである。継代4では、細胞は特性が低下し、色素が少なくなり、紡錘状の外観を示すか、またはより大きな表面積でより堅牢になります。
RPE特異的マーカーであるRPE65と細胞骨格タンパク質F-アクチンを用いてRPE細胞を検証しました。また、ミュラー細胞特異的マーカーであるビメンチンで染色することにより、ミュラー細胞による潜在的な汚染をチェックしました。このプロトコルは、既存のプロトコルを単純化したものです。
このプロトコルは、ほとんどの研究室で利用可能な材料と関連機器を使用しており、初代マウスRPE細胞を効果的に分離するのに役立ちます。
