ブンゼンバーナーを使用して3つの牧草地のピペットを火磨きすることから始め、直径を小さくします。次に、安楽死させた妊娠中のマウスダムの腹部を70%エタノールで滅菌します。恥骨合成から胸郭の剣状突起まで腹腔を切り開きます。
次に、腹腔から子宮角を抽出し、氷冷HBSS溶液で満たされた100ミリメートルのプレートに入れます。細かい鉗子を使用して、洗浄した子宮からすべての胚を抽出して分離します。抽出したマウスの胚をすばやく斬首し、HBSSで満たされた60ミリメートルのペトリ皿に頭を置きます。
脳を保持するために眼腔に一対の細い鉗子を置きます。別のペアで、脳が見えるまで皮膚と頭蓋骨をはがします。頭蓋骨から嗅球から脳をすくい取り、逆さまにします。
腹側の皮質と背側の視床下部を観察します。湾曲した鉗子を使用して、脳が白く透明になるまで髄膜と血管の層を取り除き、視床下部領域を脳の残りの部分から分離します。視床下部を3〜4個の小さな細かい断片に切断し、ピペットを使用してその断片を15ミリリットルのチューブに移します。
次に、チューブに6ミリリットルのHBSSを入れます。次に、組織が落ち着き、上清が除去されたら、酵素ミックス1を追加します。チューブを摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートし、5分ごとに攪拌して組織を再懸濁します。
次に、30マイクロリットルの酵素ミックス2を追加し、大口径の牧草地ピペットで10回上下にピペッティングして組織を解離させます。さらに10分間インキュベートした後、残りの15マイクロリットルの酵素ミックス2を追加します。直径を減少させる2つのファイアポリッシュピペットを利用して、組織を10回ピペットで入れる。
すぐに0.5%BSAを含む10ミリリットルのHBSSをチューブに追加します。次に、チューブを300 Gで室温で10分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを0.5%BSAを含む1ミリリットルのHBSSに再懸濁します。
