Rat Retina Excision and Mounting on Porous Membrane for Calcium Imaging

イメージングの2〜3週間前に、麻酔をかけたラットの眼の硝子体に、遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を運ぶウイルス粒子を注射します。眼底鏡検査とOCTを使用して、網膜構造を調べ、カルシウム指示薬注射による副作用がないか調べます。注射の2週間後、神経節細胞層またはGCLは蛍光発光を示しました。

次に、安楽死させたラットからの網膜切除が開始されます。AAV2-CAG-GCaMP5Gを発現している眼球を採取し、小さな湾曲した鉗子と細いスプリングハサミを使用して眼球の周囲の組織をすべて除去します。次に、3×3センチのろ紙を用意します。

3.5センチの皿の蓋の上に置き、濾紙にAIMS培地を浸します。眼球を紙の上に置き、前眼部をオペレーターの方に向けます。一対のまっすぐな鉗子を使用して、眼球を皿の表面から約45度の角度で保持します。

まっすぐな鉗子の間の隙間を利用して、刃で切開をガイドします。次に、眼球をAIMS培地に浸します。まっすぐな鉗子と細かいスプリングハサミを使用して、目の前部と後部を分離します。

2対のまっすぐな鉗子を使用してレンズを慎重に取り外し、網膜を強膜から取り外します。細いスプリングハサミを使用して、視神経に向かって強膜を切開し、網膜がアイカップから正常に分離されるまで切断します。網膜の切除した部分を、カットチップのプラスチックピペットを使用して取り付け膜に移します。

次に、一対のまっすぐな鉗子を使用して網膜を平らに取り付け、神経節細胞層が上向きになるようにします。次に、100マイクロリットルのピペットチップを取り付けたプラスチックピペットを使用して培地を除去し、網膜片の多孔質膜への接着を促進します。次に、アセンブリをマイクロ電極アレイまたはMEAに反転させ、GCLを電極の上に配置します。

次に、サンプルバスに酸素化AIMS培地を充填します。