私たちは、カルシウムイメージングプロトコルへの貢献のために博士S.ステラとヘレンヴォンに感謝します。私たちは、インタビューのシーンを撮影するための博士K.シートに感謝します。私たちは、原稿の彼女のコメントに博士アーリーン平野に感謝します。この研究開発プロジェクトは、遠隔医療·先端技術UCLAの医学デビッドゲフィン学校で著者によって実施され、米国陸軍医学研究および資材コマンド（USAMRMC）により授与され、投与された請負契約により可能になるとW81XWH-10-2-0077：契約番号の下MDフォートデストリックで研究センター（TATRC）、、。これらの研究のためのサポートも、NIH EY04067およびVAメリットレビュー（NB）から来た。 NCBは、VAのキャリア研究員である。

全ての実験は、実験動物のヒューマンケアと使用に関する米国公衆衛生サービス規定とカリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）の動物研究委員会によって発行された実験動物の福祉のためのガイドラインに従って実施した。 3-5週齢の間にオスとメスの成体Sprague-Dawleyラット（チャールズリバー研究所、マサチューセッツ州ウィルミントン）を使用した。 ホールマウント網膜および免疫組織化学プロトコルのための1。動物および組織の準備<ol><li>解剖顕微鏡、非常に微細な先端、はさみ、セルロース濾紙、プラスチックピペット顕微鏡スライド2鉗子：以下の材料やツールを準備します。 </li><li>深くギロチンで断頭続い1〜3％イソフルランで動物を麻酔によって、閉じたチャンバー内にラットを安楽死させる。細胞外溶液を含むペトリ皿にアイリスハサミと場所一対の目を削除します。 A、エイムズ·ミー休止diumまたは生理的溶液を推奨します。 </li><li> [フルオ-4でRGCの埋め戻しが必要な場合は、オプションのステップ]。ステップ2.3から2.4に記載されているようにフルオ-4ラベリングを実行します。 </li><li>解剖顕微鏡（光強度：1.6×10 8の光子/ mm 2の⋅sec）を使用して、眼球の前部を切断することによって角膜を除去します。ピンセットで内側の網膜表面からレンズおよび硝子を外します。硝子体を除去するには、1の鉗子でしっかりと強膜を保持することによって眼球を安定させる。静かに他の鉗子と網膜の中心に向かって硝子体ベースをはがします。この段階での製造は、凍結切片のために使用されているアイカップ、呼ばれています。凍結切片についての詳細は参考文献14,15に記載されています。 </li><li>アイカップから網膜を削除します。その後、網膜が平らすることを可能にするために4つのカットを行う。静かに光受容体層を上にして顕微鏡スライド上に網膜をマウントします。網膜に、溶液の一滴を追加し、CEを入れる網膜上lluloseろ紙。網膜は、ろ紙に付着すると、溶液中に戻って網膜を配置します。必要に応じて、ブラシや鉗子で網膜を平らに。 </li><li>固定のために10〜15分間、4％PFAにwholemounted網膜を置きます。 </li><li> 0.1 Mリン酸緩衝液（PB）（pH7.4）中で30分間wholemounted網膜を3回洗浄する。 4°Cで一晩、0.3％のTriton-X 100および0.1％のNaN 3を含む0.1M PB中の5％正常ヤギ血清またはロバ血清で網膜をブロックする。私たちは、ブロッキングのソリューションおよび抗体を保存するためのすべてのステップを500μlの最終容量を推奨。 </li><li>翌日、4℃で一次抗体5-7日で網膜のwholemountsインキュベートする。最適な希釈は、ユーザによって決定されなければならない。 </li><li> PB、0.1Mで網膜3×30分を洗浄し、一次抗体（濃度1：1,000）の種に対して向けられる、対応するフルオロフォア結合二次抗体で4℃で一晩インキュベートする。 </li><li> PBで30分間ずつ3回の最終洗浄後、培地を実装する際の網膜をマウントします。長期保管のためのマニキュアでカバーガラスを密封。店舗のサンプルを4℃で、光から保護します。 </li></ol>カルシウムインジケーター色素でラットホールマウント網膜における神経節細胞および軸索の2ラベリング<ol><li>哺乳類リンゲル含む（mM単位）125のNaCl、3のKCl、2 CaCl 2を千ミリリットル、1.25のNaH 2 PO 4、1のMgCl 2、25 NaHCO 3、および95％O 2/5％COで泡立て10グルコースを準備&#173; 2。 </li><li>ステップ1.2〜1.4で説明したように解剖を行います。 </li><li>カルシウム指示薬色素で網膜神経節細胞（RGC）およびその軸索をロードするには、注射器を用いて眼球に視神経の切り株約1mm後方へのFluo-4 pentapotassium塩（H 2 O中の40mMストック）0.5μlのを注入。の[Caの神経節細胞の動的増加を測定する2+ </SUP&gt;] iのようなのFluo-4 345 nMで、そのK dでの高い親和性を持つ指標は、最適である。フルオ-4カルシウムと結合すると&gt; 100倍の発光増大をもたらす非常に高い量子効率を有するという付加的な利点を提供しています。 </li><li>哺乳類リンゲル、95％O 2/5％COで泡立てにアイカップを置きます&#173;暗所で室温で1時間2。 </li></ol>網膜神経節細胞および軸索のための3カルシウムイメージングプロトコル。 <ol><li>ステップ1.1から1.4で説明したように、目、レンズと硝子体を除去します。アイカップから網膜を分離し、象限に分ける。マウント1象限神経節細胞をスライドガラス上の面を上にし、それを安定させるためにハープスライスグリッドを使用しています。哺乳類リンゲルで暗順応他の作品は、95％O 2/5％COで泡立ててください&#173;後で使用するために氷上で2。 </li><li>哺乳類のリンゲル液で記録チャンバーを表面かん流すると95％O 2/5％CO 2で連続的にバブリングし、溶液を維持する。 </li><li>イメージ顕微鏡下で組織。室温（〜23℃）または行動実験は、ステージを温める試料の下に水浴を加熱又は試料の表面に温風を適用することによって、生理的温度を達成する。 注：これは、多くの細胞機能は、細胞内ホメオスタシス16を維持するのに重要な役割を果たして温度によって調節されることに留意することが重要である。しかしながら、温暖化対策の導入は、光退色の速度を増大させる媒体の蒸発と熱膨張17によるドリフトの焦点を合わせることができる。室温の使用は、フルオ-4 18の細胞内区画化を減少させます。 </li><li>薬が存在しない場合に2対に高K +パルスの制御を行います。アクティブにするために、各パルスの間に33秒のために60 mMまでの3mMからO [K +]を上昇させることによりRGCをし、RGC軸索を脱分極8チャンネル重力駆動型灌流システムとVGCCs。上昇したK +溶液中のisosmolarityを維持するために、57 mMのことではNa +を減らします。 </li><li>一般的または特定のカルシウムチャネル遮断薬を用いて、カルシウムシグナルに異なるVGCCsの寄与を評価する。例えば、非特異的なカルシウムチャネル遮断薬の投与後のカルシウムシグナルの減少、コバルトは、高K + -evokedカルシウムシグナルにVGCCsの寄与の半定量的尺度を提供した。 </li><li> （ 図2）関心のRGCの周囲の関心領域（ROI）を配置することによって蛍光強度値を取得する。 </li><li>最初の高K +ピークによって生成変化に対して第二の高K +ピークにより生じる蛍光強度の変化を正規化します。その後、特定のカルシウムチャネル遮断薬の試験のために、唯一の対の第二の高K +パルス中に薬物を適用し、これに対してピークを正規化最初のピーク値。高K +ピークに対する薬物の影響を測定するためには、最初のそれによって、第2のK +のピークの振幅を分割します。分析は、薬物の非存在下で測定対に高K +のピークに由来し、その一致したコントロールに対し、これらの値で実行する必要があります。 </li><li> 5秒間隔で画像を取得します。光退色を避けるために、できるだけ低いレーザー励起を維持する。光電子増倍管は、505 nmのLPフィルタを通して蛍光発光を収集しながら、アルゴンレーザーの488nmのラインによる励起を提供します。 </li></ol>

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著者は全く開示がない。

網膜神経節細胞とその軸索のカルシウム動態を解析するために、網膜wholemountsにおける神経節細胞へのFluo-4の局在化、2）カルシウムイメージングを示すために1）免疫組織化学：この記事では、2つの異なる技術を記載している。 wholemountsを用いた免疫組織化学は、げっ歯類網膜20-23におけるタンパク質の局在を明らかにするために使用されてきた。ただし、いく?...

現在の1,2チャネルCaは全細胞のこれらの成分の薬理学的遮断を介して決定される網膜神経節細胞（RGC）は、L、N - 、P / Q-およびT-型VGCCを発現する。 VGCCは伝達物質放出、遺伝子転写、細胞調節とシナプス可塑性の3,4,5に関与している膜貫通多量体タンパク質である。チャネルの生物物理学的および薬理学的特性を確立するサブユニットを形成する大規模な、膜貫通α1細孔、2δサブユニットと細胞内のβサブユニットα、主に細胞外の補助：機能VGCCsはサブユニットの少なくとも3つの別個のクラスで構成されています。異なるα1サブユニットと、後者の2つのフォームヘテロメリック複合体および原形質膜6へのチャネルのゲーティング動態および人身売買を変える。 ここ数十年にわたり、多くの技術は、タンパク質expreを研究するために使用されてきたそのような免疫組織化学、酵素免疫測定法、ウエスタン分析およびフローサイトメトリーなどのssion、。これらの技術は、関心対象の所与のタンパク質の検出のための特異的抗体の使用を必要とし、異なる組織における特定のタンパク質の局在化および分布のための強力なツールを提供する。抗体が容易でない場合に、in situハイブリダイゼーション 、cDNAマイクロアレイおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイにおいて 、ノーザンブロット分析、RT-PCRなどの特定のタンパク質のmRNA発現レベルを検出および定量するために使用される技法は、リアルタイム定量的RT-PCRは、別のアプローチを提供する入手可能であるか、または特定のタンパク質の発現レベルが7低い場合。しかし、このような分子技術の使用への1つの制限は、遺伝子配列の同定が必要である。 網膜中のタンパク質を局在化するために、免疫組織化学は、ホールマウント網膜上で実行することができる。 RGCのアクセシビリティ、ホールマウントにより準備はRGC細胞体とその軸索に特定のタンパク質の局在を研究するための優れたプラットフォームを提供します。 それらの局在に加えて、RGCの中VGCCsのいくつかの機能的特性は、カルシウムイメージング技術の使用によって実証することができる。私たちは、選択的に細胞内カルシウム動態を測定するためにカルシウム指示薬色素でのRGCを標識するカルシウムイメージングプロトコルを記述する。異なる細胞区画内カルシウムシグナルの異なるVGCCsの寄与は、サブタイプ特異的カルシウムチャネル遮断薬を用いて単離することができる。 おそらく、ここで説明するカルシウムイメージング法の最も有益な側面の一つは、同時に独立複数のRGCおよびその軸索を記録する機能である。例えば、全細胞パッチクランプ記録のような多くの生理学的技術は、高時間分解能の膜電流の記録を、体細胞またはthesというの軸索源を提供するが記録された電子電流が判別できず、記録は、一度に1つのニューロンから作ることができる。多重電極アレイ（MEAは）同時に多数のセルからのスパイクを記録することが可能であるが、カルシウムチャネルの、例えば、異なるサブタイプの活性化を検出することも、区別することもできない。 MEAは、優先的に大きなスパイク9を生成する細胞から、指定された電極8とレコードの近くに位置している細胞から記録します。光学イメージング方法は、単一細胞の微小電極およびパッチクランプ記録とMEAの記録から得られた情報と統合することができる細胞の全集団の同時かつ独立の録音を可能にするための代替戦略を提供する。ここで説明するカルシウムイメージング技術は、RGCのカルシウム動態を研究するために使用されたが、パッチクランプおよびMEAはまた、イオン電流およびRGCのスパイク特性を解明するために並列で使用することができる。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;避難アマクリン細胞は10網膜マウスにおける神経節細胞層におけるニューロンの人口の約60％を占めているので、私たちの目標は、選択的に、合成カルシウム指示染料でのRGCを標識するローディング技術を使用していたホールマウントの準備。合成カルシウム指示薬色素が細胞内カルシウム動態の研究のための優れたプラットフォームを提供するが、その広範な使用が効果的に与えられたネットワーク内のニューロンの特定の集団をロードすることができないことによって妨げられてきた。そのようなバルク·ロード11及びエレクトロポレーション8,12などの多くの技術が、細胞の全体の集団が、しかしながら、このような技術は、特定の細胞型を区別しないロードするために行われている。遺伝的にコードされたカルシウム指示薬しかしながら、このような方法は、トランスジェニック動物13の生成を必要とする、選択的に細胞の特定の集団を標識する能力を提供する。私たちの技術は、メトを記述dは選択的にカルシウム指示薬色素の視神経の切り株の注射を介してホールマウント準備でのRGCを標識する。 総合すると、この資料に記載されている構造的および生理学的な技法は、RGCを、それらの軸索内局在およびカルシウムシグナルにVGCCsの寄与を研究するためのプラットフォームを提供します。

<table><tbody><tr><td>Straight scissors</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>Straight Forceps</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>curved iris scissors</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>dissecting tools</td></tr><tr><td>Cellulose filter paper</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td>&lt;a href=&quot;http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;amp;productID=A1247501&quot;&gt;A12475-01&lt;/a&gt;</td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.google.com/url?sa=t&amp;amp;rct=j&amp;amp;q=&amp;amp;esrc=s&amp;amp;source=web&amp;amp;cd=1&amp;amp;cad=rja&amp;amp;sqi=2&amp;amp;ved=0CC0QFjAA&amp;amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;amp;bvm=bv.48705608,d.cGE&quot;&gt;Mounting Media for Fluorescence&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotassium</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>anesthesia</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11034</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>A rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;was generated against the N-terminus of the RBPMS&amp;nbsp;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

本論文では、ツール、試薬、およびのために必要とされる実践的な手順を説明します。免疫組織化学のためのホールマウント網膜の1）成功した​​準備をして、網膜内カルシウムシグナル伝達を媒介する電位依存性カルシウムチャネル（VGCC）の研究のための2）カルシウムイメージング神経節細胞。われわれが記述するカルシウムイメージング法は、神経節細胞層内に変位アマクリン細胞の非特異的荷重に関する問題を回避する。

特異的抗体を用いて免疫標識は、網膜内の関心のある特定のタンパク質の局在を研究するためのプラットフォームを提供し、カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞とその軸索のカルシウム動態にVGCCsの寄与の研究を可能にする。 選択したRGC 19を標識する神経節細胞タンパク質RBPMS（複数のスプライシングとRNA結合タンパク質）に対する抗体を使用する?...

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K ビュー.  University of California, Los Angeles. 免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。 

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

生物工学

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

神経科学

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

生物学

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

上丘における2光子および広視野カルシウムイメージング

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

著者スポットライト:上腺における神経コーディングと視覚処理のメカニズムの解明 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

網膜神経節細胞層におけるカルシウム活性の評価

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

著者スポットライト:カルシウムイメージングを使用した神経電気刺激への革新的なアプローチ 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

電気刺激フラットマウント網膜におけるカルシウムイメージング

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

要約

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マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

イメージングカルシウム

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

電気刺激フラットマウント網膜におけるカルシウムイメージング

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

要約

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マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

イメージングカルシウム

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

電気刺激フラットマウント網膜におけるカルシウムイメージング

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング