この手順の全体的な目標は、塩化カリウムまたはATP刺激に基づいてニューロンまたはグリア応答を分化させるために、生細胞における細胞質ゾルカルシウム濃度の変化を監視することである。カルシウムは、神経伝達、可塑性、およびアポトーシスを含むいくつかの細胞プロセスに関与する重要なセカンドメッセンジャーである。Fura-2 AMなどの高選択的蛍光カルシウム色素の出現は、より優れた蛍光顕微鏡および計算方法の開発に関連して、生きた細胞および生物上のカルシウムシグナル伝達を画像化するために、高度の空間的および時間的分解能を有する高解像度光学データをもたらした。
このプロトコルは、富化ニューロン、精製グリア、または混合集団培養物に適応可能である。これは、塩化カリウムおよびATPに対する差動応答に基づいて、どの細胞型が決定的な刺激に応答したかを追跡する。塩化カリウムは細胞の膜電位を変化させます。
そして、これはニューロンによって本質的に発現される電圧ゲート化カルシウムチャネルを開く。一方、ATPはP2X7大部分チャネルを活性化し、主にグリア細胞に存在する。塩化カリウムおよびATP刺激を他の薬物と結合させることによって、細胞内カルシウム濃度の増加に基づいて、神経系のどの区画がそれらに応答しているかを見ることができる。
この手順では、いくつかの手術器具やピンセットが必要になります。バイオセーフティキャビネットを使用し、汚染を避けるためにベストプラクティスを実行します。鶏網膜培養を開始するには、空気細胞が位置する底のそばで受精卵を慎重に開きます。
内容物をペトリ皿に取り出し、一対のピンセットで断頭して胚提供を進める。頭が取り除かれたら、それをきれいなペトリ皿に持ってきて、それにカルシウムとマグネシウムを含まない溶液を加えます。次に、その過程で目を傷つけないように注意しながら、目を取り除きます。
CMF溶液を含む別のペトリ皿に目を持って行きます。ピンセットのペアで、レンズを取り外して目を解剖し始めます。次に、レンズによって残された穴から始めて、眼に3つまたは4つの縦方向の切り込みを行う。
透明な硝子体を慎重に取り外してください。網膜がそれに結合していないことを確認してください。次に、色素沈着した上皮から網膜を静かに剥離する。
残りの上皮組織をすべて除去する。網膜が完全に透明になったら、それを細かく切ります。自動ピペットの助けを借りてすべての網膜組織を取ります。
網膜を短時間遠心分離し、全てのCMFを除去した。1mLの0.25%トリプシンを加える。そして、組織を37°Cで10分間インキュベートした。
10%ウシ胎児血清を含む培地1mLを加えてトリプシン反応を停止させる。網膜を遠心分離してすべてのトリプシンを除去します。細胞を10%FCSを含む培地で2〜3回洗浄する。
次に、網膜あたり2mLの培地を加え、穏やかに機械的に解離させる。血球計数器で適切にカウントできるように細胞を希釈します。使用 15 ミリ ポリ-L-リジンとラミニンで保護されたカバースリップは、細胞の接着を助けます.
希釈した細胞を各カバースリップに50 Lピペットで貼り付けます。細胞を5%CO2雰囲気中の37°Cでインキュベートする。そして、ガラスを取り付けるためにそれらを冷やします。
これには約1〜2時間かかります。1mLの培地を加え、実験日までインキュベーターに戻した。必要に応じて、2〜3日ごとに培地の半分を交換してください。
Fura-2 AMの50gバイアルを50LのDMSOで再構成する。Krebs溶液は、蛍光測定を妨げないため、実験中に細胞を移すための良い選択肢です。開始する前に、ソリューションを 37 に予熱します。
ポロクサマー 407 を追加します。Fura-2 AM と DMSO を追加します。水浴中で7分間超音波処理する。
クレブス溶液を3つのウェルに加える6ウェルプレートを作製し、別のウェルにFura-2溶液を作用させた。Fura-2ウェルに加える前に、細胞が入ったカバースリップを3回洗ってください。細胞を37°Cおよび5%CO2雰囲気で暗所インキュベーター内で30分間インキュベートする。
インキュベーション後、もう一度3回洗ってください。クレブスを含む別の受信者に転送し、光から保護します。調製したFura-2を再利用して、より多くのカバースリップを細胞と共にインキュベートすることができる。
各実行前にカバースリップサポートとチャンバーにシリコンを追加して、溶液の漏れを防ぎます。クレブス溶液からカバースリップを取り出し、顕微鏡レンズの塩の結晶化を避けるために蒸留水で底を慎重に洗ってください。カバースリップを支持体の上に置き、境界線を慎重に押します。
カバースリップ支持体とチャンバーを顕微鏡に取り付け、Krebs溶液で細胞の灌流を開始します。適切なセルを選択し、適切なフィールドを選択します。異なる形態に基づいて細胞体を選択することにより、関心のある領域を手動で決定する。
カルシウム濃度の変動を、340および380nmでの交互励起に続いて510nmで放出される蛍光の比を定量することによって評価した。塩化カリウムを添加すると、多くの細胞が光り輝き、蛍光応答がグラフ上に上昇するのを見ることができます。塩化カリウムは、電圧ゲート付きカルシウムチャネルを開き、主にニューロンに提示する。
グラフ上の個々の線は、一意の関心領域を表します。したがって、実験中に個々の細胞応答を追跡することができる。ATP刺激は、グリア細胞によって本質的に発現されるP2X7受容体を開く。
これは豊かなニューロン文化です。したがって、ここにはグリア細胞はほとんどありません。これが、ATP刺激に反応する細胞が非常に少ない理由です。
取得した値は、Metafluorソフトウェアを使用して処理されました。実験結果は Excel テーブルで表され、各行は個々のセルを表し、各行はタイム ポイントを表します。Excelソフトウェアを使用すると、個々の細胞のカルシウム変動を別々に、またはそれらのすべてのカルシウム変動を同じグラフでプロットすることができます。
任意の刺激に対する反応性細胞の量を定量化するには、カルシウムベースラインレベルを増加させる30%のカットオフを設定します。ここでは、胚発生8日目のひよこの培養中の網膜細胞を用いて、50mmの塩化カリウムと1mmのATP刺激を受けた後、カルシウムの観点からニューロンとグリアシグナルがどのように変化するかを調べます。各実験において、約100個の細胞が容易に分析された。
図Aは、ニューロンとグリアの両方を含む混合培養物を表し、1週間維持した。応答を定量化すると、分析された細胞の約半分が塩化カリウムに答え、残りの半分がATPに応答したことがわかります。図Bは、ニューロン富化培養物を指す。
それはわずか3日間インキュベートされたので、ほとんどのグリア細胞はまだ分化していない。この場合、細胞の89%が塩化カリウムに答え、ニューロンの有病率を補強する。図Cは、精製グリア培養物を示す。
これらの細胞を3日ごとに培地交換しながら10日間維持した。その後、ほとんどのニューロンが死に、グリアだけが残ります。実際、この培養物はATPによってのみ活性化された。
この方法論は、セカンドメッセンジャーとしてのカルシウムの普遍的な性質のために広く使用されてきた。表現型解析は、カルシウムイメージング後の固定細胞の免疫化学でこの方法論を補完することによって強化することができます。このプロトコールはまた、他のカルシウムチャネルを発現する他の混合細胞系にも適合させることができる。
重要なヒントは、表現型発現と相関する異なるタイプの細胞の選択的応答を見つけることである。
