NIHは、R01 HL085369を与えます。

1。ストック溶液の高度な準備<ol><li>脱イオン水で、事前にタイロード液（16倍）の二つのストック溶液を調製し、4℃に保存° C： <ol class="lalpha"><li>株式I（119.872グラム/ LのNaCl、3.056グラム/ LのCaCl 2（2H 2 O）、5.6 g / LのKClを、2.6274グラム/ LのNaH 2 PO 4、3.408グラム/ LのMgCl 2（6H 2 O）、（フィッシャー科学的な、フェアローン、ニュージャージー州））; </li><li>株式II（26.88グラム/ L NaHCO3水溶液、（フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州））。 </li></ol></li><li>蛍光色素のストック溶液を準備します。繰り返し凍結融解を避けるために、我々は、-20℃、一つの実験のために十分である時、両方の染料の30μlのアリコートを格納します。 <ol class="lalpha"><li>膜電位感受性色素RH237（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）ストック溶液、ジメチルスルホキシド、1.25 mg / mLの溶液（DMSO、Sigma社、セントルイス、MO）; </li><li>カルシウム指示薬rhodo -の異形2AM（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）ストック溶液、DMSOで1 mg / mL溶液。 </li></ol></li><li>事前に（バイオサイエンスTocris、セントルイス、MO、DMSOで2 mg / mLの溶液を）興奮収縮脱共役剤のblebbistatinのストック溶液を調製し、4℃で溶解blebbistatin℃にて保存してください。 </li></ol> 2。灌流液と実験7を準備する<ol start="4"><li>たて2Lタイロード液（128.2mM NaClを、1.3mmの塩化カルシウム（2H 2 O）、4.7 mm使用のKCl、1.05mMのMgCl 2（6H 2 O）、1.19mMのNaH 2 PO 4、20mMのNaHCO 3を 、11.1mM D -グルコースを準備脱イオン水、pHの= 7.35 ± 0.05）。ストック溶液は、タイロード液（一つの実験のための十分な）証券私、証券II 125mlの125 mLの脱イオン水と混合の1750 mLを取り、グルコースの4グラムの2Lにするために使用されている場合。 </li><li>灌流システムの2台のポンプをオンにします。 40ml /分の逆行性灌流のために使用される蠕動ポンプ（ペリスター、WPI、サラソタ、米国）を設定します。灌流のために使用され、80 mL / minに保持タンクに戻って灌流液を返すために他の蠕動ポンプ（コール - パーマーMasterflex PeristalicポンプL / S、コール - パーマーインスツルメント社、ヴァーノンヒルズ、イリノイ州）を設定します。 </li><li> 30分間70％エタノールとし、2L、脱イオン水で灌流系を洗ってください。 </li><li>一度、すべての脱イオン水をチャンバーから排気され、タイロード液を循環し、5μmのフィルター（ミリポア、ビルリカ、MA、米国）に通すことになります。溶液中にO 2 / CO 2（95％/ 5％）ガスをバブリングすることにより37℃にウォータジャケットとサーキュレータとC（ThermoNESLAB EX7、ニュータウン、米国）と灌流液酸素を送り込むの灌流液を温める。 pHメーター（Oaktonインスツルメンツ、ヴァーノンヒルズ、イリノイ州）との溶液のpHを監視し、7.35 ± 0.05で、pHを保つためにO 2 / CO 2バブリングの速度を調整する。実験中のモニタのpHと温度を継続する。 </li><li>デュアル光学マッピング装置は、高い空間（100x100ピクセル、230 ±ピクセルあたり20ミクロン）と時間的（1000〜3000フレーム/秒）の分解能を持つ2つのMICAMアルティマ- L CMOSカメラ（SciMedia、コスタメサ、カリフォルニア）で構成されています。指定されたカルシウムイメージングカメラの前でバンドパスフィルター（590 ± 15nmの、Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州）を修正、一方、ロングパスフィルタは、（&gt; 700nmの、Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州）に配置する必要があります指定された電圧のイメージングカメラの正面。カメラは、ダイクロイックミラー（635 nmのカットオフ、オメガオプティカル、ブラトルバロ、バーモント州）が含まれているホルダー、によって互いに垂直に配置されています。すぐにデュアルカメラホルダーの下にダイクロイックミラーの上に心臓からの放出光を焦点レンズ（ニコンニッコール55ミリメートル1:1.4 235052）、がある。ワーキングディスタンスは約3センチメートルです。 励起光は、ハロゲンランプ（ニューポートオリエインスツルメンツ、ストラットフォード、コネチカット州、SciMedia、コスタメサ、CA）によって生成され、熱のフィルター、シャッター、およびバンドパスフィルタ（520 ± 45 nm）を介して渡されます。フレキシブルライトガイドは、準備の上にバンドパスフィルタ処理されたライトを指示し、シャッターは準備が染料の退色を避けるために、画像取得時にのみ光にさらされることを保証するために使用されます。 </li><li>事前にペーシングおよびセンシングのためのAg / AgCl電極2電極を準備し、心臓を配置する前にチャンバー内にインストールしてください。アンプとフィルタが適切なレベルに調整されていることを確認します。 </li></ol> 3。 、マウスの心臓を収穫カニューレを挿入する、およびランゲンドルフ灌流を設定する<ol start="10"><li>と腹腔内注射によるヘパリン（100単位）、ケタミン/キシラジン（キシラジン、10 mg / kg体重ケタミン、体重を80mg/kg）でマウスを麻酔。痛みの反射の欠如によって麻酔の適切なレベルを確保する。 </li><li>半ば胸骨切開後、すぐに心臓を削除し、（95％O 2、5％CO 2）酸素でそれを洗う、一定温度（37 ± 1℃）タイロード液。 </li><li>解剖顕微鏡の使い方、急速に大動脈を識別し、右鎖骨下動脈下行大動脈を介してクリーンなカットを行います。大動脈の短いセクションは、フレアチップと21ゲージのカニューレをカスタムメイドに添付されます。 4から0黒編み絹縫合糸（手術スペシャリティー社、読書、PA）は、カニューレに心臓を修復するために使用されます。カニューレ挿入後、心臓が逆行性に灌流されると、タイロード液で灌流。ブリッジアンプTBM4M、WPI、サラソタ、、逆行性灌流率は60および80 mmHgの（圧力トランスデューサ、世界精密器械株式会社（WPI）、サラソタ、米国との間の大動脈圧を保つに2-5 mL / minの範囲で調整され米国）。 </li><li>心臓がカニューレを挿入された後、肺、胸腺、および脂肪組織は、切開して削除されます。 </li><li>単離心臓は、ストリーム誘発性運動を防ぐために、灌流チャンバーの底部（Sylgardのコート）に頂点に（ファイン科学ツール）固定されます。右と左心房の付属も延伸し、心房の光学測定のために最大の表面積を提供するチャンバーの底に（ファイン科学のツール、株式会社、フォスターシティー、CA）に固定されます。 非常に重要！小さなシリコンチューブは、肺静脈を通って左心室に挿入し、近くの結合組織に絹縫合糸で固定されています。これは、（パート4のステップ19を参照）興奮収縮脱共役剤による心室収縮の抑制後に特に重要である左心室の中に閉じ込め灌流液、の解の混雑と酸性化を防ぎます。 </li><li>カスタムメイドの電極は、マスター- 8（AMPインスツルメンツ株式会社、エルサレム、イスラエル）またはのPowerLab 26T（ADインスツルメンツ、シドニー、オーストラリア）によって生成されるペーシング刺激を、行うために心臓の表面に配置されます。 </li><li>小さなカバーガラスが振動解からのモーションアーチファクトを減らすために、心臓上の解決策の表面に固定されています。 </li><li>心臓の励起光の焦点を合わせる。さらに、デュアルカメラ装置と最大解像度が得られるように心臓の間の距離を調整する。 </li><li>部屋ですべてのライトをオフにするとPowerLab 26Tを使用して、電気録音を開始する。 </li></ol> 4。負荷電圧とカルシウム感受性色素と興奮収縮脱共役剤<ol start="19"><li> blebbistatinのウォームアップ0.6mlを。保持している貯水池の灌流液でblebbistatin 0.5 mLを混ぜる。タイロード溶液1mLにblebbistatinの残りの0.1mLを希釈し、ゆっくりカニューレの近くに位置する薬剤ポートを介して（20分かけ）、それを注入する。 blebbistatinが徐々に動きのアーチファクトを減少させると観察。 </li><li> 1 mLのタイロード溶液中で膜電位感受性色素RH237ストック溶液30μLを希釈し、ゆっくりblebbistatinと同じ射出ポートに5-7分にわたって注入する。 </li><li> 30μLカルシウムインジケーターrhodo -の異形2 AMは、1 mLのタイロード液で希釈し、ゆっくりと同一の注入ポートを通って5〜10分間にわたって適用しプルロニックF127（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州、DMSOの20％溶液）と混合し、1:1である。 </li><li> blebbistatinと細胞膜と細胞質に到達するための染料のために5〜10分間待ちます。動きが完全に抑制されているプロトコルに進みます。 </li><li>継続的に心臓の正常な電気的機能を確保するための手順全体にわたってECG記録を監視する。 </li><li> SciMediaカスタムソフトウェアを（SciMedia、コスタメサ、カリフォルニア）を使用して蛍光シグナルの録音を開始する。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" /> 図1。灌流のための実験装置、電気録音と光学マッピング。 EM =放出、LP =ロングパス<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" /> 図2実験準備と心室ペーシング中に記録された信号の例。左：ECG信号は、Ag / AgCl電極2のディスク電極（トップ）とS1S1刺激プロトコルの例（下）に示されているから収集されます。センター：ランゲンドルフマウスの心臓の準備。右：代表的な光学活動電位と心房（上）と心室（下）からのカルシウムトランジェント信号が表示されます。黄色の矢印は、（トップ）心房レコーディングに見られる心室からの蛍光信号の散乱、を指します。 LV =左心室; =右心室RV、LA =左心房、RA =右心房<img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" /> 図3。野生型マウスの心臓の心室からV mとCATの代表的な光学録音。その光学録音（C）に見られる黒い点でマークされた等間隔の位置の配列を持つA.は、実験的な準備。アレイ上の中央の位置からV mと猫のトレースB.例（ボックスを参照してください私n個の（C））。等間隔の位置の配列からC V M（青）と猫（赤）。信号は、3x3ビニングされた。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" /> 図4。アクティベーションマップと伝導。 A.は、横方向（T）と縦（L）方向と野生型マウスの心臓から例のアクティベーションマップは、白い矢印で示した。 B. V mの信号（上）とに見られる三点へのdV / dt（ボトム）に対応する（T1、T2、T3、L1、L2、L3）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" /> 図5。活動電位およびカルシウム過渡期間の分析。 80％再分極（APD80）と80％の緩和（80カナダドル）マップでのカルシウム過渡期間におけるAの活動電位持続時間は、制御条件の下で心臓（左）から、30 nMのイソプロテレノールアプリケーション（右）の後に表示されます。心室の黄/緑の色は、（右）APD80と80カナダドルを短縮イソ​​プロテレノールを示している。野生型マウスの心室（トップ）と心房（下）からAPD80と80カナダドルのB.の例では、トレーシング。

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	<li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+maps+of+intracellular+[Ca2+]i+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts.">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts.">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li><li>Pruvot, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+calcium+cycling+versus+restitution+in+the+mechanism+of+repolarization+alternans.">Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans.</a> Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).</li><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li><li>Fast, V. G., Dhein, S., Delmoar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+action+potential+using+voltage+sensitive+dyes.">Recording action potential using voltage sensitive dyes.</a> Practical methods in cardiovascular research. , 233-255 (2005).</li><li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+K(ATP)+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart.">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li><li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia.">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+electrode+polarization+in+the+far+field:+implications+for+external+defibrillation.">Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).</li><li>Hammouda, M., Kinosita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coronary+circulation+in+the+isolated+heart.">The coronary circulation in the isolated heart.</a> J Physiol. 61, 615-628 (1926).</li><li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts.">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li><li>Lou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity.">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li><li>Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+new,+long-wavelength,+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart.">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

この実験では、興奮収縮脱共役剤による心室収縮の抑制後に特に重要である小さなシリコンチューブを、追加することによって、ランゲンドルフ灌流法を変更。シリコンチューブは、ソリューションの混雑、灌流液の酸性化、および左心室の虚血の発症を予防するために使用されます。マウスの心臓では、低体温に非常に敏感であり、従って、心臓全体の温度変化が活動電位の持続時間で人工的な違いが発生します。その結果、加熱システムは、実験8の全体の間に37℃の一定温度を維持するために、灌流チャンバ内に実装されました。ランゲンドルフモデルは、心臓の神経支配を保持しないので、人は生理的交感神経と副交感神経トーン9を調べるために、潅流液に神経伝達物質の追加を検討する必要があります。逆行性灌流に加えて、心臓の灌流の加算は、pHや温度などの好適な環境パラメータを維持するのに役立ちます。この方法では、ランゲンドルフ灌流心臓を水平に置かれた。垂直ランゲンドルフ灌流のセットアップは、10を使用することもできますが、わずかに異なる心臓力学11になることがあります。 CMOSカメラのほかに、別の検出器も提供されており、マップV mと同時にCAT 12に適用することができます。 高い時空間解像度のCMOSカメラのアプリケーションは、録音の精度を保証しますが、光学マッピングの信号は、単一セルからではありません。むしろ、それぞれの蛍光シグナルは、光学倍率に応じて、細胞の数百または数千から来ている。はるかに大きな心室の蛍光は、光散乱による心房信号を歪めることができるので、光学的に記録した信号の慎重な解釈が必要です。マウスの準備のもう一つの制限は、心臓13の小さなサイズのため、表面の曲率によって誘導された信号の歪みとノイズです。伝導速度の測定のみならず、マウスの心臓の曲率からだけでなく、電極の極性と仮想電極から変更することができます。伝導速度、活性化の異方性、および再分極マップのために精度を達成するために、心臓の表面にカメラの焦点を修正することが不可欠です。 この方法では、リアルタイムでECG記録は、心臓電気生理学の光学的調査を補完することができます。膜電位感受性色素（RH237）とカルシウム指示薬（rhodo -の異形2AMが）ので、その高速応答のプロトコル、同じような励起、および別個の発光スペクトル3,7で使用されています。 V mとRH237とrhodo -の異形2AM 3以外の猫を測定するために使用できる染料の代替手段の組み合わせがあります。大きなストークのシフト（&gt; 200nmの）を有する新規膜電位感受性色素、PGHIは、理由PGHIとrhodo -の異形2AM 14との間の発光波長の大きい分離の良いV mとCATの信号を許可することがわかった。今後の改善点は、新規な蛍光プローブ、新しいイメージング検出器の開発、および改良された画像処理ソフトウェアを探索に焦点を当てることができる。 3D光学マッピングのための高解像度と新しい光イメージングモダリティも光学マッピング5の将来の方向性が重要です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 化学 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> NaClの</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S271 - 1 </td></tr><tr><td>のCaCl 2（2H 2 O） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> C79 - 500 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S217 - 500 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（6H 2 O） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> M33 - 500 </td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4（H 2 O） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S369 - 500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S233 - 3 </td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> D16 - 1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td>バイオサイエンスTocris、エリスヴィル、ミズーリ</td><td> 1760 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> S1109 </td></tr><tr><td> rhodo -の異形2AM </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> R1244 </td></tr><tr><td>プルロニックF127 </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> P3000MP </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>シグマ、セントルイス、MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart

マウスの心臓では、この種の遺伝子工学のための低コスト技術の存在に起因する心血管研究のための人気モデルです。マウスの心臓の心血管系の生理的な表現型解析は容易に膜電位（V M）、カルシウムトランジェント（CAT）、およびその他のパラメータのための様々なプローブを用いて蛍光イメージングを使用して行うことができます。興奮収縮連関は、活動電位と細胞内カルシウム動態によって特徴づけられるので、心1-4同じ場所から同時にV mとCATの両方をマッピングするために非常に重要である。ランゲンドルフから同時光学マッピングでは、マウスの心臓は心不全、不整脈、代謝性疾患、および他の心臓疾患のメカニズムを解明する可能性を秘めている灌流。活性化の可視化は、伝導速度、活動電位持続時間、およびサイトの無数にある他のパラメータは、細胞レベルの調査から達成することはできませんが、よく光学マッピング1,5,6によって解決されます。本稿では、最先端のCMOSイメージング技術を用いた高時空間分解能でマウスの心の中でV mとCATの同時光学マッピングのための計測のセットアップと、実験条件を示す。この方法で得られる一貫性のある光学式の録音は、ランゲンドルフ灌流マウス心臓のその同時光学マッピングが可能で信頼性の両方である示しています。

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

そのまま孤立ランゲンドルフ灌流マウス心臓における本論文では詳細解剖の手順を、楽器のセットアップ、および実験条件膜電位の光学マッピング（VM）の間と細胞内カルシウムトランジェント（CAT）。

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

optical-mapping-action-potentials-calcium-transients-mouse

Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.0K ビュー.  Washington University in St. Louis. そのまま孤立ランゲンドルフ灌流マウス心臓における本論文では詳細解剖の手順を、楽器のセットアップ、および実験条件膜電位の光学マッピング（VM）の間と細胞内カルシウムトランジェント（CAT）。

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

細胞融合の検出のためのCre - LOX Pの組換えのアプローチインビボでの</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

ネイティブ、繊維状の長い間隔と分節ロング間隔コラーゲンのin vitro合成

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

房室弁の二軸の機械特性

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...