まず、ハサミを使ってレンズペーパーの小片を切り、ペトリ皿に入れます。次に、マウスから分離された固定された脳と脊椎を含むホルマリンを、ろ紙で裏打ちされた漏斗に注ぎます。脳と脊椎を空のペトリ皿に移します。
メスを使って脳を6つの冠状部分に分けます。鉗子を使用して、脳標本をペトリ皿のレンズ紙の半分に移します。メスを使って脊髄を3つに切り、脊髄が見えるようになるまで尾端の仙骨棘片を切ります。
利き手ではない方の手で胸椎をつまみます。利き手で歯をしっかりと閉じたアドソン鉗子を取り、穏やかなねじりの動きで端を脊柱の小さな開口部にそっと押し込みます。次に、鉗子を使用して、出現した脊髄を柱からそっと引き出し、レンズペーパーを含むペトリ皿にコードピースを置きます。
メスを使用して、3つの脊髄片を小さな断面片に分割します。これらのピースを、脳のピースを含むレンズペーパーの同じ半分に配置します。レンズペーパーを折りたたんでティッシュ片を挟み、ラベル付きのカセットに入れます。
カセットをホルマリンの入った標本瓶に移します。インキュベーション後、カセットを検体容器から自動組織処理装置の最初のホルマリン浴に移し、処理装置を一晩運転します。翌日、組織処理装置からカセットを取り出し、パラフィン包埋ステーションの温かい保持室に移し、パラフィンワックスを流し込んで金型の底を覆います。
細かい鉗子を使用して、脳冠状動脈と脊髄の断面片を型の底にあるパラフィンに入れます。金型を冷却面に数秒間移し、脳と標本を所定の位置に固定します。金型を加熱面に戻し、上部にホットパラフィンを入れます。
試験片IDのラベルが付いたカセット蓋を金型に置きます。カセット蓋の上にパラフィンを注ぎます。金型を冷却ステーションに移して、ワックスを硬化させます。
ブロックが完全に冷めたら、回転式ミクロトームにブロックを固定します。ブロックをトリミングし、各パラフィンブロックの5マイクロメートルのセクションを切断します。パラフィンリボンを摂氏42度のウォーターバスに移します。
脊髄切片を 4 つの象限で観察し、各象限に脱髄病変の存在をスコアリングします。このセクションは、4 つの象限すべてに病変があるため、スコアは 4 です。病変は 1 つの象限にしかないため、このセクションは 1 点を採点します。
CD45染色は、病変に白血球が存在することを示している。新しい病変には、古い病変と比較して多くのCD45細胞が含まれています。対照的に、新しい病変は、古い病変と比較して、SMI-32陽性軸索が少ない可能性があります。
野生型群のマウスは、完全な麻痺を伴う重度のEAEを発症した。一方、OGR1-KO群は軽症を発症した。この臨床スコアの差は、髄膜下脱髄病変の変動、脊髄で染色されたミエリン面積の割合、さらに、ミエリンの割合もOGR1と野生型マウスで有意に異なり、累積EAEスコアと相関していました。
EAEでは、脳の炎症は主に小脳と脳幹に局在しています。髄膜、心室付近、視神経や脳梁などの他の白質経路を含む脳に、炎症の追加の領域が明らかになることがあります。低分子アレイアッセイで測定した血清ニューロフィラメント光は、健康なマウスと比較してEAEマウスの血清ニューロフィラメント光レベルが高く、これらのレベルの上昇は脊髄のSMI-32陽性の密度と相関していました。
