我々は議論のためブッフホルツ研究所とシグマアルドリッチのRNAi -チームのメンバーに感謝したい。私たちは、マックスプランク協会とBundesministeriumこだわりBildungウントForschungグランプリ[0315105]サポート情報 - バイオに感謝します。 MISSION ®はSigma - AldrichはバイオテクノロジーLPの登録商標です。

1。高品質のミッションesiRNAライブラリ<ol><li>興味のあるすべての遺伝子のためにRNAiの影響を最も受けやすいと特定のターゲット領域はDEQORアルゴリズム（http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html）を利用して選択されます。すべての4 DEQORスコアサイレンシングの可能性ターゲットmRNAの可能性が21ヌクレオチドの長siRNAは、最先端の設計の制約より4。さらに、それぞれの潜在的なsiRNAは、研究の生物のトランスクリプトームに対するBLAST検索を実行することによって、他の遺伝子との交差反応性可能性について分析する。プログラムは、それによって全体的な品質と潜在的なesiRNA（300〜600 bpの長さ）のクロスサイレンシング能力の分析を提供します。 </li><li> cDNAをターゲット遺伝子の選択した領域は、バクテリオファージRNA -ポリメラーゼプロモーター配列に隣接する遺伝子特異的プライマーを用いたPCRによって増幅される。 </li><li>ミッションesiRNAの生産に使用されるすべてのPCR産物は、キャリパーLabchip解析により配列決定によって同一性および純度のための検証されます。 </li><li>長い二本鎖RNAが転写された鎖のアニーリングに続く、RNAポリメラーゼによってPCR産物から転写される。 </li><li> esiRNAsは、Q -セファロースのスピンカラムを利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製してRNaseIIIを使用して、長い二本鎖RNAの制限酵素消化によって調製される。 </li><li> esiRNAsが析出し、TE緩衝液に再懸濁する。収率は、UV -吸収測定によって測定され、濃度は、TEバッファーの適切な量に溶解して調整されます。最終製品の全体的な品質は、キャリパーLabchip分析により確認された。 </li></ol> 2。細胞株を選択し、スクリーニングのためにトランスフェクションを最適化<ol><li> esiRNA（ポジティブおよびネガティブコントロールとして、ウミシイタケルシフェラーゼとして使用Eg5）と384ウェルプレートでトランスフェクション試薬の量を増加させるの滴の量は、48時間細胞をインキュベートを追加。 Eg5は双極紡錘​​体集合と枯渇のために必要なキネシンのモータータンパク質が有糸分裂停止につながるです。異なるトランスフェクション試薬と細胞株について、この手順を繰り返します。ここで、我々は、トランスフェクション試薬として標準的な手順とオリゴフェクトアミン（Invitrogen社）に続く培養したHeLa細胞を使用してください。 </li><li>最適なトランスフェクション条件を選択するための有糸分裂停止（丸形）と光学顕微鏡によるウミシイタケルシフェラーゼ（RLUC）esiRNAをトランスフェクションした細胞の総数を表示Eg5 esiRNAsでトランスフェクトされた細胞を数える。 RLUCには、少なくとも毒性とEg5のための最も顕著な表現型との条件を選択してください。 トランスフェクション条件を最適化するための代替方法は、恒常的活性プロモーターの制御下にEG​​FPを（または他の適当なレポーター遺伝子）を発現する安定細胞株を含む。 EGFP（または別のレポーター遺伝子）とRLUC（または別の適切な陰性対照esiRNA）などの蛍光アシストセルソーティング（FACS）により測定ノックダウン効果と毒性に対するesiRNAのトランスフェクション後。 EGFPのために使用esiRNAは、ターゲットmRNAに完全に相補的であることを確認してください。 </li></ol> 3。プライマリ画面5,6の設定<ol><li>自動化されたピペッティングステーション（例えばアクエリアス、テカンとWellMate、マトリックス）上のすべての使用されるコンポーネントのためのピペッティングの精度を最適化する。ピペッティングのパラメータは、ソリューション、ボリュームとプレート型のタイプに応じて変化するため、この最適化は個別にすべてのステップのために反復する必要があります。可能であれば、ピペッティングステーションは、汚染を避けるために、層流フードの下に配置する必要があります。すべての使用されるコンポーネントは、該当する場合はオートクレーブして、75％エタノールを噴霧してどちらかの使用前に消毒されるべきである。ウェルからのクロスコンタミネーションがうまく除外されるように洗って、プロトコルを最適化する。自動化されたピペッティングの最適化の詳細は、スペースの制約を与えるためのものと利用ピペッティングステーションに大きく依存することはできません。詳細については、プロトコルを製造するために参照してください。 </li><li> Eg5とRLUC用esiRNAsで上から最適化された条件を用いて384ウェルフォーマットでのトランスフェクション細胞。プレート全体をカバーするEg5とRLUC esiRNAのための交互のパターンを使用してください。 </li><li> 48時間のインキュベーションが冷たい100％エタノールで細胞を固定した後、1μg/ mlのDAPIおよび100μg/ mlのRNase Aを（Qiagen）を含むPBSで25分間染色、15分間PBSで再水和する。最後に4℃でPBSと店舗で洗浄℃に</li><li>オリンパスScanRシステム上で顕微鏡などによるDAPI蛍光の測定強度。細胞数に対してDAPI強度をプロットすることにより、ヒストグラムを生成し、G1期のためにDNA -コンテンツの2Nと細胞の割合を計算することによって、細胞周期の分布を評価する。&lt;2N&gt; S相の4N、G2/M-phase用4Nと異数性/倍数性のための&gt; 4N。 </li><li>プレート上の結果の均質性を評価する。結果は、位置のEFFEを除外するために大幅に異なる場合は、さらに最適化が必要ですCTS。マルチウェルプレートを使用して一般的な問題は、インキュベーション時間の間にエッジの井戸で強化された蒸発です。これは多くの場合、板の位置特異的な効果に変換する別の井戸の異なる実験条件、につながる。このような理由から、我々は、画面の空のすべてのエッジの井戸を残すことをお勧めします。さらに蒸発を最小限に抑えるためには、インキュベーターが高湿度に保たれていることを確認します。我々はまた、日常的にこのような蒸発をブロックコーニング通気性のシールテープなどの蒸発障壁を採用しています。また、位置効果のための他のリソースは考慮、例えば、技術的な読み出しシステムの変化（顕微鏡、プレートリーダー、など）や液体ハンドリング（勾配、ソリューションの不均一性、等）のばらつき考慮する必要があります。 </li><li>陽性および陰性対照との間に統計学的な違いは、雇用検定の重要性の尺度を提供しています。ネガティブコントロール（またはバックグラウンドノイズ、モックコントロール）の間に大きな違いは、サンプルでは、​​実際のスクリーニングを開始する前に確立する必要があります。統計的有意性のための良好な尺度は、Z -因子である。 Z -係数は次式以下の式で計算されます。 Z = 1 - （3 SD [サンプル] + 3 SD [モック]）*（| AV [サンプル] - AV [モック] |）-1; SD付：標準偏差、AV：平均。 1のZ因子&gt; Z&gt; 0.5は、ポジティブコントロール7から陰性コントロールの統計的に有意な分離（およびノイズ）を示します。 </li></ol> 4。主な画面<ol><li>上記の最適化条件を利用esiRNAsのトランスフェクションのために384ウェル組織培養プレートを準備します。ここでは、ウェルあたり5μlのTE緩衝液に溶解15ng esiRNAを使用してください。プレート当たり少なくとも8つの制御位置は、研究対象の生物学的プロセスに適したポジティブコントロールとネガティブコントロール（：Eg5とRLUCここ）でロードする必要があります。エッジの井戸のみ5μlのTE bufferでロードされる位置の影響を避けるために。 </li><li>ウェルあたり0.2μlオリゴフェクトアミンを含む5μlのOPTIMEMを（Invitrogen）を追加し、混合し、室温で20分間インキュベートする。 </li><li>トランスフェクション混合物の上に細胞懸濁液（ここで25細胞/μlの濃度でHeLa細胞の細胞懸濁液の40μlの、ウェル当たり1000個の細胞に相当）を追加し、72時間インキュベートします。 </li><li>自動顕微鏡（オリンパスScanR、上記参照）でDNA含量を測定する。ヒットの選択のためのZ -スコアの統計情報を使用して評価する：Z -スコアは、基準として負の制御用信号を使用して、すべてのサンプルesiRNAsに対して計算されます。 （注）、Z -スコアは、Z -ファクターと同じではありません。 Z -スコアは、（モック）対照と比較して、サンプル値の有意性のための統計的尺度を提供しています。それは、方程式は、次の式で計算されます。 Z =（値[サンプル] -平均[モック]）*標準偏差[モック] -1。 ヒットの選択のしきい値は適用する必要があります。通常は、重要性の基準が好き：2 &lt;Z &lt;-2を使用するが、データセットの品質に応じて、生物学的プロセスまたは単に画面の範囲を検討され、別のしきい値が必要となる場合があります。かなり簡単なZ -スコアの統計情報の横にも、より精巧な数学的評価手法は、（スクリーニングデータの統計的評価の幅広い分野への最初の内部にはマロらで見つけることができます。8）使用することができます。 </li></ol> 5。二次スクリーンとヒットの検証<ol><li>二次の画面では、実験誤差やオフターゲット効果による偽陽性を排除するために、主画面に従います。選択されたヒットの場合、主画面で使用したのと同じ手順では、より良い統計的評価を可能にするために複製の大きい番号（3-5）を繰り返す必要があります。 </li><li>検証されたヒットの場合、初期画面で識別された目標に対する二次の非オーバーラップesiRNAは（または他の非オーバーラップサイレンのトリガ）を使用する必要があります。同じアッセイおよび読み出しは、一次スクリーニング用として適用する必要があります。 </li><li>最終的に選択された遺伝子は、異種間のRNAiレスキュー9によって検証することができます。それによって遺伝子のマウスのオルソログなど細菌人工染色体（BAC）のエンコーディングを安定的に細胞にトランスフェクトされる。 BAC -コンストラクトは、そのゲノムの文脈で遺伝子を保持し、ほぼ生理的な発現を可能にする。内因性のヒト遺伝子に対するRNAiは、RNAi表現型を救出変更されず、マウスの導入遺伝子の発現を残す。 RNAiによる救助は、これまでに利用可能なRNAiの表現型の検証のためのゴールドスタンダードを提供します。 </li><li>最後に、検証済みの候補者は最終的には機構的理解を得るために、より詳細に研究されています。多くの場合、RNAiは二次、より精巧なアッセイでは、例えば、これらの実験で使用することができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

著者は、提出された仕事に関心を持っている可能性が商業的実体との財政関係を宣言する。

RNA干渉は、機能喪失型の表現型を研究するために標準的な技術となっている。 RNAiは、メディエーターの大規模なコレクションは、別の業者から入手可能であり、遺伝子サイレンシングのための簡単​​で、費用対効果が高く迅速な方法を提供しています。これは、異なる種や細胞タイプの広い範囲でのゲノム規模の視点を可能にする多くの生物学的プロセスにおけるキープレーヤーのための体系的なスクリーニングのためのゲートを開けた。 高い偽陽性と偽陰性率は、RNAiスクリーニングにおける共通の課題です。この問題を解決するために、かなりの努力が効果を向上させるために投資し、特にサイレンシングの特異性は、トリガされています。重要な発見は、同じ転写産物をターゲットに異なるsiRNAのプールは非常に標的特異性を高めることだった。異なるsiRNAの非常に複雑なプールがエンドリボヌクレアーゼによって生成されているため、esiRNAsはRNAiスクリーニングの偽陽性率を減少させる、高い標的特異性のトリガーです。 esiRNAsはまたも偽陰性率を低減する、効率的なノックダウンを達成するために示されている。 RNAiスクリーニングの技術的な要求されているため、彼らはおそらくしばらくの間、定期的に実行するために挑戦的なままになります。試薬と器具をより良く、より多くの研究室が自分の専門知識を共有し得るようにしかし、現代生物学におけるRNAiスクリーニングの使用は今後も増加するものとみなされます。

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

RNA干渉（RNAi）は遺伝子発現の制御のための基本的な細胞メカニズムです。 RNAiはまた、低分子干渉RNA（siRNA）として知られている短い二本鎖RNAによって誘導される。短い二本鎖RNAはDicerによって、エンドヌクレアーゼのRNase IIIファミリーのタンパク質の活性によって長い二本鎖の前駆体に由来する。得られた断片は、同種の標的mRNAにそれを指示、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）のコンポーネントです。 RISCは、それによってコードされるタンパク質1,2,3の発現を減少させる標的mRNAを切断する。 RNAiは、低分子干渉RNAを利用した哺乳動物細胞における遺伝子機能の研究の損失のための強力で広く使用されている実験的な方法となっている。 現在、2つの主な方法は低分子干渉RNAの生産のための利用可能です。別の方法は in vitro でのRNase IIIによってターゲット固有の長い二本鎖RNAのエンドヌクレアーゼ的切断を採用したのに対し、一つの方法は、化学合成を含む。これにより、siRNA様オリゴヌクレオチドの多様なプールは、エンドリボヌクレアーゼに準備したsiRNAまたはesiRNAとして知られて生成されます。化学的に誘導されたsiRNAとesiRNAsの有効性の比較は、両方のトリガーは、標的遺伝子のサイレンシングに強力であることを示しています。特異性を比較するときの違いは、しかし、見ることができます。 esiRNAsに内 ​​在する複雑な混合物はより具体的なノックダウン10につながる一方、多くの単一の化学的に合成されたsiRNAは、著名なオフターゲット効果を生み出す。 本研究では、我々は、ゲノム規模のミッションesiRNAライブラリと細胞周期の進行に関与する遺伝子の同定のためのDNA -コンテンツの画面に代表されるRNAiスクリーニングのためのその活用のデザインを提示。我々は、トランスフェクションプロトコルと高スループットのスクリーニングのためのアッセイを最適化する方法を示します。我々はまた、統計的に評価できる方法大規模なデータセットを示し、主要なヒットを検証する方法を提示する。最後に、我々は検証のヒット、さらに機能的特性評価のための潜在的な出発点を与える。

Watch this Scientific Journal Video about MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells at JoVE.com

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

ここでは、細胞分裂に関与する遺伝子のハイスループットスクリーニングに人間esiRNAライブラリを使用してください。我々は、セットアップとesiRNA画面だけでなく、どのように結果を分析し、検証するために実施する方法を示します。

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K ビュー.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. ここでは、細胞分裂に関与する遺伝子のハイスループットスクリーニングに人間esiRNAライブラリを使用してください。我々は、セットアップとesiRNA画面だけでなく、どのように結果を分析し、検証するために実施する方法を示します。

ビデオ: MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

生物学

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

RNAiのエフェクターの細菌配達：Transkingdom RNAiの

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

ミッションLentiPlexは、哺乳動物細胞ではshRNAライブラリースクリーニングをプールされた

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.