MISSIONは、シグマアルドリッチバイオテクノロジーLPの登録商標です。 LentiPlexは、シグマアルドリッチバイオテクノロジーLPの商標です。

LentiPlexプールされた画面のセットアップ興味のshRNA配列を識別するには、それは細胞の大部分は1つだけshRNAをコンストラクトを受け取るように画面を設定することが重要です。 （感染多重度）低MOIを使用して、セルごとに複数のintegrantsの確率が大幅に減少している。しかし、形質導入効率、したがって、目的の湿気は、標的細胞の種類に強く依存する。したがって、最適なMOIの判断は、新しい細胞のタイプの画面を起動する前に実施されることが不可欠です。 1。 shRNAのライブラリプールされたミッションのLentiPlexと標的細胞の伝達<ol><li>使用されるMOI実際には、異なる細胞タイプごとに異なります。望まれる複製場合は、プレートの数はそれに応じて増やす必要があります。さらに、一般的にそれは別のサブプールを組み合わせることは有益ではないことになります。サブプールを別に持つことでデコンボリューション処理に役立ちます。 propeを確認してください伝達の間に適用されるサブプール番号と各組織の培養皿のrのラベリング。低MOIは、セルごとに複数のintegrantsの確率を低減することをお勧めします。 </li><li> 1日目 - 翌日（合計で10のプール、= 30皿合計3回の反復実験を行い、それぞれ）で〜70％コンフルエントを取得するために十分な細胞を60 - mmディッシュのシードを適切な数。私たちの研究のために、60 mmの培養ディッシュは、前の情報伝達〜70％のコンフルエンシーを達成するために6 × 105 A549細胞を播種した。これは、細胞が対数増殖期に残っていることを保証します。成長率は、細胞のタイプによって異なりますし、画面を起動する前に決定しなければならない。 </li><li>細胞は37℃で一晩インキュベートCの加湿インキュベーター中で5％CO 2の雰囲気の中でで付着することができます。 </li><li> （省略可能）ネガ​​ティブコントロールshRNAの持つ形質導入のための二つの追加、60 mmディッシュを含めます。ラベル料理はSHC001HとSHC002Hのための&quot;コントロールB&quot;のために&quot;制御&quot;。 </li><li> 2日目 - 形質導入目LentiPlexウイルス粒子と電子の細胞。トランスダクションの日に、氷の上でレンチウイルス粒子を解凍。 </li><li>層流フードへの融解粒子を移し、すぐに使用されていない場合は氷上に置きます。 </li><li>計算どのくらいのすべての細胞培養皿全体にMOI 1を取得するセルに追加する個々のウイルスのサブプールの。 <ol><li> 例：1 × 10 6細胞/ディッシュ、ウイルス力価= 5 × 10 8 TU / mlに、所望のMOI 1。 I.）1 × 10 6細胞/皿×（MOI 1）= 1 × 10 6形質導入ユニット（TU）は、Cから得られるII。）1 × 10 6 TU /（5.0 × 10 8 TU / ml）を必要とレンチウイルスストック溶液の= 2μLの適切な皿に追加する必要があります。細胞の培養皿に追加されたウイルスのより良い流通を確保するために、完全なメディアの100〜300μLでウイルスの計算量を希釈する。 </li></ol></li><li>事前に播種した細胞からメディアを取り外します。完全なメディアコンタを追加します。各皿にiningヘキサジメトリンブロマイド溶液。メディアのヘキサジメトリン臭の推奨最終濃度が8μg/ mlのです。あなたはそれがあなたの標的細胞に有毒であることが判明した場合少ないヘキサジメトリンブロマイドを使用してください。 </li><li>所定の実験設計に従って適切な料理にしたshRNAレンチウイルス粒子を追加。優しくスワールプレートが均等に細胞全体にウイルスを配布する。 </li><li> 37℃で18-20時間のインキュベート℃、5％CO 2の大気中の加湿インキュベーター中C。 </li><li>コントロールディッシュBのとSHC002Hが（スクランブルshRNAを対照）実験を通して、実験皿と同じようにこれらの料理を扱うコントロールディッシュで（空のベクターのshRNAコントロール）SHC001HとMOI同一で（省略可）3-8。 </li><li> 3日目 - メディアを変更します。ウイルスを含む培地を吸引除去し、新鮮な完全培地を（臭化ヘキサジメトリンなし）に追加します。 37℃で一晩細胞をインキュベートする。 </li></ol> 2。メッキ扱う治療コンポーネント/試薬で細胞<ol><li> 4日目 - 井戸から吸引メディアと最適濃度の治療成分を含む新鮮な培地を加​​える。培養条件と同様に、治療法は変わるし、適切な濃度と持続時間を事前に決定されるべきである。私たちの研究では、パクリタキセルのTRAILおよび1μMの100 ng / mLを使用。細胞を48時間処理した。 </li><li>生存細胞をT75フラスコに再播種し、ほぼ100％コンフルエントになるまで拡大して許可する必要があります。 </li><li> （オプション）選択の最後に、皿とコントロールディッシュB.皿と皿のBを制御検査は、プールされた各ライブラリの料理の少なくとも一つより少ないコロニーを持つ必要があります。皿のコロニーが予想外に高い数値がある場合は、どちら伝達プロセスが所望の表現型や選択圧に関連する経路に影響を与えているよりも、アッセイの十分に強いと再最適化ではないが必要になることがあります。皿Bは、あまりにも多くのコロニーが含まれている場合、その後、RNAi経路のshRNAのと婚約の式は、関心の表現型に影響を及ぼす可能性があります。これはSHC001Hの場合の繰り返しの場合、効果がSHC002Hに固有のものでないことを確認します。 </li></ol> 3。ポリクローナル細胞集団からデコンボリューション<ol><li>各サブプールから不均一な細胞集団を収穫し、ゲノムDNAを分離する。ゲノムDNAがGenElute哺乳類のゲノムミニプレップキットと付属のプロトコール（シグマアルドリッチ、G1N70）を用いて分離される前に、我々の試験では、細胞をPBSで軽く洗浄し、トリプシン処理した。また、現在市場で入手可能なその他のゲノム精製キットは、DNAの分離に使用することができます。培養細胞の開始量のた​​めにプロトコルの勧告に従うことが重要です。 </li><li>ターゲットのPCR増幅。 shRNAのテンプレートのリカバリ手順は、選択された細胞集団からのshRNAが挿入さのプール全体の増幅、またはINDIVIの検索を可能にします個々に選ばれ、拡張されたコロニーからデュアルのshRNAテンプレート。コントロールと選択された標的細胞からのshRNAのインサートの増幅後、PCR産物の配列を決定することができます。 </li><li>このPCR増幅ステップはシグマReadyMix、カタログ番号P2893を使用して最適化されていました。他の試薬は、増幅のために使用することができますが、サイクリングの条件及び/またはマグネシウムの濃度は、良好な増幅のために変更する必要があります。濃度の20mMで増幅プライマーは、LentiPlexのキットに同梱されています。 </li><li>表1に記載したようにPCR反応をセットアップします。記載されている順序でコンポーネントを追加します。に記載の金額は、1つの50μLの反応のためのものです。より多くの反応の場合、反応の希望数によってマスターミックス成分をスケーリングし、10％の超過などがあります。 DNAテンプレートの量が推奨さは50-100 ngのです。 </li><li>それは強くつの反応のためのテンプレートがapproprに希釈したMISSION shRNAの人間のポジティブコントロールベクターで構成されていることをお勧めします。濃度をiate。このテンプレートを使用して成功した増幅はPCRのアッセイ成分とサイクリングの条件が適切であることを示しています。注意：実験試料と試薬のキャリーオーバーコンタミネーションを防ぐために、それをポジティブコントロールは、その後のPCR反応が設定されている場所とは別の場所に希釈されることが示唆された。 </li><li>あなたのサーモサイクラー中に表2に記載されているPCRプログラムを保存します。 </li><li>各サンプルについて、DirectLoadの5μLと一緒に染料及び電気泳動させるの1μLで3μLのPCR反応™PCRは100bp低ラダー、カタログ番号D3687 1％アガロースゲル上で309 bpのアンプリコンの存在を確認することを組み合わせる。 </li><li> PCR増幅産物のサブクローニング：PCR産物は、TOPOは、製造者のプロトコール（Invitrogen社、K4575 - 01）に続く、TOPO - TAクローニングキットを用いてクローニングした。結果は、1つPCR産物をそれぞれのベクトルに含まれていることです。 </li><li> 250個々の細菌コロニーは、（それぞれが個々のPCRアンプリコンを含む）を単離し、成長した100 mg / mLのアンピシリンを含むLB 2mLの培養におけるn。プラスミドDNAをGenEluteプラスミドミニプレップキット（Sigma - Aldrich社、PLN70）を用いて抽出した。 </li><li>プラスミドDNAを精製することをEcoRIで消化し、インサートの有無を確認するために電気泳動した。 </li><li>プラスミドDNAのサンプルを、配列決定し、shRNAが挿入はLentiPlexライブラリで提供さLentiPlex shRNA配列検索データベースを用いて同定した。 </li></ol> 4。ターゲットの同定とバリデーション<ol><li> shRNA配列は、5&#39; - GAAACACCGG - 3&#39;で開始します。同封のshRNA配列の検索のAccessデータベースのフォームの検索ボックスにクエリ配列として、少なくとも10の次が21未満のヌクレオチドを​​入力してください。 </li><li>プールされたshRNAの種を選択します。に応じて、シーケンスが発見されたからサブプールを選択します。 </li><li>今すぐ検索を実行するには、&quot;潜在的なヒットを検索&quot;ボタンをクリックしてください。これは、番目に一致する、対応するTRC shRNA配列（複数可）を特定する必要がありますeはデータをシーケンシング。 TRC shRNA配列の詳細については（複数可）を識別し、対応する遺伝子標的を容易にシグマアルドリッチのお気に入りの遺伝子で見つけることができる。 <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li>同定された標的遺伝子は、元のTRCのクローンに1を加えたウェルフォーマットに1 shRNAを使用して同じ遺伝子をターゲットに少なくとも2つの追加のshRNAを、元のスクリーニングアッセイを繰り返して検証する必要があります。真のヒットは、井戸の大半で同じ表現型を表示します。 </li></ol> 5。代表的な結果 LentiPlexプールされた画面のワークフローの例を図1に詳述されています。 TRAILとパクリタキセルの存在下で増殖している形質細胞がフラスコがコンフルエントになるまで拡大させた。ゲノムDNAを回収し、PCR増幅及びクローニングを図1に示すように、シーケンシングおよびshRNAの識別のために提出される前のようなふぃぎゅで記述されていたRE 1 C. 250クローンは、これら25の、配列決定した複数のクローンで表され、残りの225は唯一の1クローンで表され、この時点で追求されていなかった。 図2に示すように、TBX3、PPP2CA、およびAKT2を含むいくつかの候補遺伝子は、複数のクローンで表されていました。 T -ボックス転写因子、TBX3は4つのクローンの合計で登場し、腫瘍の移行5に関与している。 PPP2CAのダウンレギュレーションは、6アポトーシスアンドロゲン欠乏で誘導される細胞周期停止と予防を緩和することにより、アンドロゲン欠乏条件で培養したLNCaP細胞の成長を維持するために実証されています。 AKT2は、癌の開発7、8でいくつかの役割を果たすことが実証RAC -βセリン/スレオニンプロテインキナーゼと推定される癌遺伝子である。 <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="表1" /> のMg 2 *最終濃度+溶液中では3 mmとなります。1.5mMのを 、Taq ReadyMixとマグネシウムの塩化物溶液から1.5 mMから貢献しています。 表1。Lentiplex PCRの反応条件 <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="表2" /> 表2。Lentiplex PCR増幅プログラム <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="図1a" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="図1b" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="図1c" /> 図1。画面をプールされた（A）LentiPlex、（B）ポリクローナルデコンボリューションのワークフロー、およびshRNAのターゲットの（C）同定。 A.のLentiPlexは、画面をプールした。まず、シードの細胞は、その後（合計で10のプール、3回の反復実験を行い、それぞれ、合計で30皿用）、shRNAのサブプールを追加。次に、治療成分/試薬（私たちの場合は、TRAILおよびPAで扱うそれぞれclitaxel、）。その後、フラスコ内で生存細胞を再シードし、拡大することが可能。収穫は、異種の各サブプールからの細胞の人口およびゲノムDNAを分離する。 B.ポリクローナルデコンボリューションは。shRNAを挿入物を含むDNAを増幅するPCRを実施する。テンプレートgDNAをもポリクローナル頃からPCR産物のサイズは均一ですが、シーケンス中のポリクローナルです。 PCR産物をベクターにクローニングし、有能な細菌に変換されます。 shRNAのターゲットのC.同定個々のコロニーを単離しているとプラスミドDNAが抽出される。各クローンは、一人の個人のPCR断片とクローニングベクターが含まれています。プラスミドDNAを挿入し、配列の存在を確認するために消化される。 shRNAのインサートはLentiPlex shRNA配列検索データベースを使用して識別されます。 <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。できる識別didate遺伝子。25の候補遺伝子は、複数のヒットがあったことを同定した。 225の候補遺伝子は1つだけヒットしていたし、追求されませんでした。候補遺伝子ごとに個々のクローンの内訳については補足表1を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="表1" /> 補足表1。ポリクローナルシーケンシング遺伝子IDから識別される個々のTRCライブラリのクローンが検出されたクローンをヒット。

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マシューJ. Coussens、コートニーコーマン、アシュリーL.フィッシャー、ジャックサゴ、そしてジョンスウォーザウトは、この記事で使用するツールや試薬を作るSigma - Aldrich社、によって雇用されている。

本研究では、我々は、パクリタキセル/ TRAIL治療後のA549細胞の細胞毒性に関与する遺伝子を同定するゲノムワイド画面を提示する。ゲノムワイドな画面で、プールされたアプローチの使用は、通常、従来のアレイの画面に関連付けられている時間、コスト、および設備投資を削減。画面の成功に不可欠事前に実行される最適化の実験です。伝達条件とMOIを経験的に決定する必要があります。 選択方法は、所望の表現型（例えば、生存、表面のタンパク質発現、等）を提示する細胞の堅牢な選択を許可する必要があります。これらのパラメータの最適化は、検出された偽陽性の数が削減されます。 ここでは、ゲノムDNAは、選択された細胞の大部分母集団から収穫した後、TOPOは、個々のshRNAが挿入を識別するために、クローニングした。この実験のための一つの可能​​な改善が確実にFACSを用いて生細胞のために選択するだけだ唯一生きている細胞を回収すること。特定されたターゲットは、スクリーニングアッセイでターゲット固有のshRNAの持つ伝達によって検証されます。真のヒットは、井戸の大多数の表現型が表示されます。 LentiPlexプールされたライブラリは、そのアプリケーションに柔軟性があります。それは、下流のアプリケーションの広範な互換性があり、正または負のどちらか選択の戦略で使用することができます。スクリーニングの条件に応じて、shRNAを挿入のデコンボリューションは、PCR /クローニング、マイクロアレイ、または次世代シーケンシング9、10を介して達成される。RNAiスクリーニングをdeconvoluteにこれらの技術のパワーとスピードが十分に確立されている間、マイクロアレイでの関心事と次世代シーケンシングの方法は、バイオインフォマティクスのリソースや知識を正しく分析し、実験結果を解釈するために必要なの可用性です。これらの技術に関連する費用は、しばしば、ゲノムワイド画面の事業への障壁になることができます。 APCR /クローニングベースのアプローチ、マイクロアレイや次世代シーケンシングほどは強力で効果的かつ低コストの代替手段です。 アジレントはLentiPlex画面のさらなる支援にTRC shRNAのライブラリに基づいてカスタムアレイを提供しています。これらのオプションは、研究者が細胞機能の多様な範囲を勉強するLentiPlexを使用することができます。

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlexプールされた配列</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">シグマアルドリッチ</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> A549細胞</td><td> ATCC </td><td> CCL - 185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">シグマアルドリッチ</a> </td><td><html> oductDetail.do？LANG = EN＆N4 = T5694％7CSIGMA＆N5 = SEARCH_CONCAT_PNO％7CBRAND_KEY＆F = SPEC&quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">パクリタキセル</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">シグマアルドリッチ</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> TOPO TAクローニングキット</td><td>インビトロジェン</td><td> K4575 - 01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">ジャンプスタートTaqポリメラーゼReadyMix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">シグマアルドリッチ</a> </td><td>ONCAT_PNO％7CBRAND_KEY＆F = SPEC&quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenEluteプラスミドミニプレップキット</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">シグマアルドリッチ</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">ヘキサジメトリン臭</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">シグマアルドリッチ</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ TD&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

RNA干渉（RNAi）は遺伝子発現の調節のための本質的な細胞メカニズムです。活用するこのシステムの生来のパワーは、遺伝子機能研究の損失でノックダウンの遺伝子の発現レベルを可能にしています。 RNAi実験を行うための2つの主要な方法があります。最初は化学的に合成される低分子干渉RNA（siRNA）の使用です、2番目はプラスミド1内のエンコードされたショートヘアピンRNA（shRNA）を利用しています。後者は、直接細胞にトランスフェクションまたは複製無能なレンチウイルス粒子にパッケージすることができます。レンチウイルスshRNAを使用する主な利点は、細胞型、安定的に長期の遺伝子ノックダウンと選択のためのゲノムに統合する能力、および機能の画面の高スループットの損失を行う上でその有効性の多種多様に導入が容易であることです。これを容易にするために我々はshRNAライブラリーをプールされたLentiPlexを作成しました。 MISSIONのLentiPlex人間のshRNAのプールライブラリは、独自のプロセスを使用して生成したゲノムワイドなレンチウイルスのプールです。ライブラリは15,000をターゲットにTRCのコレクションから75000以上のshRNAコンストラクト+ヒト遺伝子2で構成されています。各ライブラリは、堅牢なライブラリのカバレッジを確保するため、製品のリリース前に、shRNAの表現のためにテストされています。ライブラリは、P24アッセイを介して少なくとも5 × 10 8 TU / mlの力価ですぐに使用できるレンチウイルス形式で提供していますされ、事前分割約8,000 shRNAの十サブプールにそれぞれを構築する。増幅とシークエンシングプライマーはまた、下流のターゲットを識別するために提供されています。 A549細胞は、ヒト肺癌細胞株3、4におけるパクリタキセルと組み合わせると、これまでの研究では、エクストレイルの相乗抗腫瘍活性を設立。本研究では、プールされたLentiPlexのshRNAライブラリのアプリケーションは急速に細胞毒性Oに関与する遺伝子の正の選択画面を実施する方法を示しますF A549細胞TRAILとパクリタキセルにさらさ​​れる。頻繁に高スループットのスクリーンで遭遇する一つの障壁はコストとデコンボリューションすることが困難であり、我々はまた、詳細伝統的なシーケンシングを利用したコスト効率の高いポリクローナルなアプローチを。

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MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

ここでは、細胞の生存を促進する遺伝子標的を同定するために人間のLentiPlexプールされたライブラリと伝統的なシーケンシングメソッドを使用します。我々はセットアップとdeconvolute LentiPlexの画面を表示し、結果を検証する方法を示します。

ミッションLentiPlexは、哺乳動物細胞ではshRNAライブラリースクリーニングをプールされた

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.5K ビュー.  Sigma-Aldrich. ここでは、細胞の生存を促進する遺伝子標的を同定するために人間のLentiPlexプールされたライブラリと伝統的なシーケンシングメソッドを使用します。我々はセットアップとdeconvolute LentiPlexの画面を表示し、結果を検証する方法を示します。

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

生物学

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...