この作品は、受賞数R01HG006785下の国立衛生研究所の国立ヒトゲノム研究所によってサポートされていました。

1配列設計と合成<ol><li>調節活性についてアッセイすべき配列の設計と合成にMPRAを開始します。 pMPRAベクターシリーズとの互換性のために、次のテンプレートを使用して、各シーケンスを設計する：5&#39;-ACTGGCCGCTTCACTG-のVAR -GGTACCTCTAGA- タグ -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 varはアッセイすべき配列を意味し、 タグは 、1つまたは複数の識別タグを表す&#39;。 </li><li> 2つの可変領域（varとタグ ） は 、それらの間のレポーター遺伝子断片の方向性ライゲーションを容易にするためにKpnI（GGTACC）およびXbaI（TCTAGA）制限部位の対によって分離されている。さらに、2つの別個のSfiI（GGCCNNNNNGGCC）部位はpMPRA骨格に指向性ライゲーションを可能にするPCRによって追加される。可変領域は、これらの制限部位のいずれかの追加のコピーを含んではならない。必要であれば、これらの制限酵素の1つ以上が置換され得る限り代替品として1）に近いDNA分子の末端への効率的な切断を可能にし、2）ベクター配列の他の場所で切断しない。追加の詳細についての説明を参照してください。 </li><li>商用ベンダーから、表1にリストされている必要なプライマーを入手します。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="381"><tbody><tr><td> MPRA_SfiI_F </td><td> GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R </td><td> GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC </td></tr><tr><td> TAGseq_P1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT </td></tr><tr><td> TAGseq_P2 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [インデックス] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG </td></tr></tbody></table> 表1プライマー配列。[インデックス]多重化された配列決定のために使用される6〜8ヌクレオチドのインデックスシーケンスを示している。異なる屈折率を有する少なくとも8 TagSeq-P2プライマーを取得します。すべてプライマーのHPLCまたはPAGEによって精製されるべきである。 <ol start="4"><li>オリゴヌクレオチドライブラリーは、商業ベンダーまたはコア施設から得られた、または製造者によって記載されるようにプログラム可能なマイクロアレイに基づくオリゴヌクレオチド合成機を用いて生成することができる。 100μlのTE 0.1バッファにOLSの製品を再懸濁します。 </li><li> 10％TBE-尿素変性ポリアクリルアミドゲル上のオリゴヌクレオチドライブラリーを実行します。その品質（ 図2A）を評価するのssDNA感受性蛍光染色でレーンや汚れ当たり約1ピコモルをロードします。 </li><li>完全長のオリゴヌクレオチドに対応する離散的なバンドが可視化することができる場合（ 図2A、レーン1および2）、対応するアクリルアミドゲルスライスを切り出し、振盪しながら室温で一晩、100μlのTE 0.1にオリゴヌクレオチドを溶出する。そうでなければ、生のOLS懸濁液を用い進みます。 </li><li>エマルジ ​​ョンPCR 9を使用して、オリゴヌクレオチドライブラリーへのSfiI尾を増幅し、追加</<html> SUP&gt;。 </li><li> 表2に記載したように、50μlのPCR反応混合物をセットアップします。その後、4℃で5分間、300μlのMicellula DNAエマルジ ​​ョンからの油と界面活性剤の混合物および精製キットおよび渦と組み合わせる。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="368"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1倍容量（μL） </td></tr><tr><td>ヘラクレスII融合DNAポリメラーゼ</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>ヘラクレスII反応緩衝液を5倍</td><td> 10 </td></tr><tr><td>のdNTP（それぞれ10mM） </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> BSA（20 mg / ml）を</td><td> 1.25 </td></tr><tr><td>プライマーMPRA_SfiI_F（25μM） </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td>プライマーMPRA_SfiI_R（25μM） </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> OLSテンプレート（1-10 attomol） </td><td>変わる</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 50 </td></tr></tbody></table>ve_content &quot;&gt; 表2エマルジ ​​ョンPCR反応混合物（水相）。 <ol start="9"><li>アーティファクトの出現なしに増幅産物の最大収量が得られる濃度を使用してください（セクション1.12を参照）。 </li><li> PCRチューブに得られたエマルジョンを分配し、95℃（2分20サイクルのPCRを行い、20×[95℃で20秒、55°C、72°Cで30秒、20秒]、95℃で3分間°C）。 </li><li>プールDNA精製カラムを用いて増幅産物を精製し、次いでイソブタノールを1ml添加​​し、短時間ボルテックスし、そしてにより各350μlのエマルジョンPCR反応を破壊する。 </li><li>アーチファクトのない増幅（ 図2B）を確認するために、2％または4％アガロースゲル上でアリコートを実行する。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig2highres.jpg" /> オリゴヌクレオチド合成ライブラリーの調製図。A） </s·チョン&gt;三つの異なる生のオリゴヌクレオチド合成ライブラリ（OLS）は、10％TBE-尿素変性ポリアクリルアミドゲル上で実行されます。完全長オリゴヌクレオチド（*）に対応するバンドを可視化し、ライブラリ1から切り出し、2ライブラリ3は、PAGE精製を妨害する汚染物質が含まれていることができます。この場合は、アガロースゲル上で同一のオリゴヌクレオチドライブラリーのランの開放およびエマルジ ​​ョンPCR増幅のPCR増幅。B）製品に直接進む。複雑なオリゴヌクレオチドライブラリーのPCR増幅は、頻繁に上位と下位のバンドとして表示されることがあり、キメラ製品、その他の成果物を作成します。エマルジョンPCRは、これらの成果物を最小限に抑えることができます。 2ライブラリー構築<ol><li> 1％アガロースゲル上で泳動し、2時間、50℃でのSfiIを有するベクターpMPRA1を消化することによって線状化プラスミドバックボーンを準備し、（この場合、2.5キロバイト）をバックボーンバンドを切り出し、ゲル精製スピンカラムを用いて精製する。 </li><li>ダイジェスト2時間、50℃でのSfiIとステップ1.4からのエマルジ ​​ョンPCR産物およびDNA精製カラムを用いて精製する。 </li><li> 、線状化ベクターバックボーンにプロモーター - タグライブラリを連結するために消化したPCR産物100ngの、直線化ベクター骨格およびT4 DNAリガーゼ50ngのを含む反応を設定します。 16℃で一晩インキュベートし、次にリガーゼを不活性化するために20分間65℃で加熱する。 </li><li> E.トランスフォームライゲーション反応で大腸菌 。ライブラリの複雑さを維持するために、設計されたライブラリ内の個別のプロモーター - タグ組み合わせが存在するよりも、少なくとも10倍以上のCFUを得ることを目指しています。 </li><li>タグの合計数​​は約10万である場合、ターゲットのcfuは、典型的には、ライブラリごと6-8パラレル変換を実行することによって達成することができる。 </li><li>各形質転換のために、50μlのエレクトロコンピを組み合わせる氷上の連結混合物2μlを持つ大腸菌細胞 。エレクトロポレーションによりトランスフォーム、800μlのSOCの細胞を回収1時間37℃で振とうによって培地、その後、パラレル変換から細胞を兼ね備えています。 </li><li> 50〜100 / mlのカルベニシリンを含むLB寒天プレート上で回収された細胞のalinquotから、プレート連続希釈を形質転換効率を評価し、37℃で一晩インキュベートする。 / V、Vが回収された細胞とvの全容積で連続希釈に要した一定分量の体積である-総CFUとして（観測CFU）×（希釈倍率）×（V V）を推定する。 </li><li>同時に、回収された細胞の残りは100μgの/ mlのカルベニシリンを補充した200ミリリットルのLBに接種するために使用する。シェーカーインキュベーター内で37℃で一晩、細胞を成長させ、その後、標準的な手順に従って、プラスミドDNAを単離する。 </li><li> 2時間50℃でのSfiIを有する単離プラスミドライブラリーのアリコートを消化し ​​、インサートの存在を確認するために1％アガロースゲル上で泳動。 </li><li> cでプラスミドライブラリーを直線化KpnI及びXbaIでを使用して、プロモーター変異体とタグの間にウッティング。消化効率を最大化するために、シリアル消化を実行します。 </li><li>まず、1時間、37℃でKpnIで消化し ​​た磁気ビーズを用い精製する。第二に、2時間、37℃で1 Uエビアルカリホスファターゼを添加したXbaIで消化、熱は、5分間65℃で不活性化し、その後、磁気ビーズを用いて精製する。 </li><li>完全な線形化を確認するために1％アガロースゲル上でアリコートを実行する。ノーカットプラスミドが表示されている場合は、線形化された断片をゲル精製しなければならない。 </li><li>哺乳動物細胞へのトランスフェクションに適しMPRAライブラリを生成するには、線形化された中間ライブラリにのKpnI / XbaIで互換の端部とのORFを連結。 </li><li> pMPRAdonor1から互換luc2 ORF断片を調製し、1時間37℃でKpnI及びXbaIでこのプラスミドを消化し ​​、1％アガロースゲル上で泳動。 ORFのフラグメントを切り出し（1.7 Kこの場合、b）およびゲル精製スピンカラムを用いて精製する。 </li><li>ステップ2.3から2.8に記載されているように線形化された中間ライブラリにORFのフラグメントをクローニングします。 </li><li> 1時間、37℃でKpnIでMPRAライブラリ（1-2μgのに対応）分量を消化し ​​、1％アガロースゲル上で実行されます。消化されたライブラリが単一のバンドとして実行する場合、追加のバンドが認められた場合には、（通常は中間の構築物のキャリーオーバーに相当）のセクション3に進んで次のように、ライブラリは、さらに精製することができる。 </li><li> 1時間、37℃でKpnIで汚染されたライブラリの3-5μgのを消化し ​​、4℃で一晩0.8％アガロースゲル上で実行されます。 </li><li> 、正しいライブラリバンドを切り出し、ゲル精製スピンカラムを用いてDNAを精製し、1時間37℃で高濃度T4 DNAリガーゼを使用してセルフライゲーションを行う。ステップ2.8で説明したようにその後転換および最終ライブラリーDNAの単離を繰り返します。 </li></ol> 3 Transfection、摂動、およびRNAの単離<ol><li>それぞれ独立したトランスフェクション、文化、適切な培地中の細胞に必要な数（MPRAライブラリの複雑さによって決定されるように、ディスカッションを参照）。例えば、DMEM中で培養HEK293T / 17細胞を、10％FBSおよびL-グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。各ライブラリおよび実験条件について、少なくとも2つの独立したトランスフェクションのための培養細胞。 </li><li> MPRAプラスミドを用いて培養細胞をトランスフェクション。トランスフェクション方法および条件は、各細胞型について最適化されなければならない。各トランスフェクトサンプルについて、一致させた対照として、プラスミドDNAの一部（50〜100 ngの）を保持。 </li><li>例えば、1ミリリットルのOpti-MEM中10μgのプラスミドDNAを用いた10cmの培養皿内の約50％コンフルエンスまで増殖させた0.5×10 7 HEK293T / 17細胞をトランス私は30μlのリポフェクタミンLTXと10μlのPLUS試薬を使用した低血清培地。 5時間後、トランスフェクション混合物を削除し、許可する細胞は24〜48時間回復する。 </li><li>必要に応じて、設計されたライブラリ内の文脈や信号依存調節配列を活性化するために必要な摂動を行う。 </li><li>細胞を採取し、そのメーカーの指示を使用して、標準的なオリゴ（dT）セルロースカラムやビーズを使用してポリ（A）+ mRNAを単離する。 </li><li>カラムやビーズの最大結合容量は採取された細胞から期待するmRNAの総量を超えていることを確認してください。例えば、セクション3.3から予想される収量は約0.5〜2.5μgのmRNAである。 </li></ol> 4。タグ配列<ol><li>トランスフェクトされた細胞溶解物からベクターDNAのキャリーオーバーをなくすために、で2.4μlのターボDNアーゼ不活性化試薬を、1時間、37℃で1μlのターボのDNase（2U）と、2.3μlの10倍のターボのDNaseバッファーで各20μlのmRNA試料を扱う追加その後、混合、90秒10,000 gで遠心分離し、新しいチューブにソリューションを移すとの5分間のRT。 </li><li>確認する<html>各mRNAサンプルの60〜100 ngの上のセクション4.6で説明した後、アガロースゲル上で製品を実行するようにしてPCRを行うことにより、純度。 （luc2でpMPRA1を使用している場合は0.25キロバイト）特定のアンプリコンが表示されている場合、その列は、処理されたmRNAを精製した後、DNase処理を繰り返します。 </li><li> 、タグ配列のシーケンシングライブラリーを作製cDNAにレポーターmRNAを変換して、PCRによる配列決定アダプターを追加します。 </li><li> 表3に記載したようにmRNAを/ RTプライマー混合物をセットアップします。その後、氷上に置き、5分間65℃でインキュベートする。 表4に記載したように並行して、cDNA合成反応をセットアップする。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1倍容量（μL） </td></tr><tr><td> mRNAサンプル（400〜700 ngの合計） </td><td> 8 </td></tr><tr><td>オリゴ0dT（50μM） </td><td> 1 </td></tr><tr><td>のdNTP（それぞれ10mM） </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>cDNA合成のため ove_content &quot;&gt; 表3 RNA /逆転写プライマーミックス。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1倍容量（μL） </td></tr><tr><td> 10倍のスーパースクリプトIII RTバッファー</td><td> 2 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25mMの） </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT（0.1M） </td><td> 2 </td></tr><tr><td> RNaseOut（40 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td>スーパースクリプトIII（200 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 表4 cDNA合成反応混合物。 <ol start="5"><li>ゆっくりするmRNA / RTプライマーがcDNA合成ミックスと混合兼ね備えています。 50分、5分、85℃、50℃でインキュベートした後、氷上に置きます。最後に、20分間37℃で2 UリボヌクレアーゼのHでインキュベートする。 </li><li> 4-6μlの表5に記載したようにPCR反応をセットアップしますcDNA反応混合物または鋳型として50 ngのレポータープラスミド。そして（3分間、72°C [30秒間、30秒間、30秒間95°C 72°Cで55°C]を2分間、26 xに対して95°C）PCR増幅を行う。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1倍容量（μL） </td></tr><tr><td> PfuUltra II HotStartのPCRマスターミックスの2倍</td><td> 25 </td></tr><tr><td>プライマーTagSeq_P1（25μM） </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>プライマーTagSeq_P2（25μM） </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>テンプレート（mRNAは、cDNAの混合物またはプラスミドDNA） </td><td>変わる</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 50 </td></tr></tbody></table> 表5タグ配列のPCR反応ミックス。 <ol start="7"><li> 2％アガロースゲルでPCR産物を実行し、タグ配列のライブラリアンプリコンに対応する物品のバンド（0.25キロバイト使用している場合luc2とpMPRA1）、これらを用いてゲル精製スピンカラムを精製する。 </li><li>プール、イルミナシーケンシング装置と直接、精製タグ配列アンプリコンを変性させ、配列決定する。 </li><li>低品質a）はシーケンスされたタグ内に30未満のスコアまたはb）正確に設計されたタグと一致していないのPhred品質で一つ以上の位置が含まれているすべてのことを削除することで読み込みフィルター。残りの各タグは、各ライブラリに表示された回数をカウントします。 TPMに（百万配列を決定したタグごとにタグ）タグ数を正規化した後、シーケンシングライブラリの各ペアのためのプラスミド由来のタグカウントオーバーのmRNA由来のタグカウントの比を計算する。複数の異なるタグが各配列変異体に結合させた場合には、下流の解析のために彼らの中央値の比率を使用しています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence.">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li><li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay.">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).</li><li>Patwardhan, R. P., Lee, C., Litvin, O., Young, D. L., Pe&#8217;er, D., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+of+DNA+regulatory+elements+by+synthetic+saturation+mutagenesis.">High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis.</a> Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).</li><li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo.">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li><li>Arnold, C. D., Gerlach, D., Stelzer, C., Bory&#324;, &. #. 3. 2. 1. ;. M., Rath, M., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantitative+enhancer+activity+maps+identified+by+STARR-seq.">Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq.</a> Science (New York, N. Y.). 339 (6123), 1074-1077 (2013).</li><li>Kheradpour, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+dissection+of+regulatory+motifs+in+2000+predicted+human+enhancers+using+a+massively+parallel+reporter+assay.">Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay.</a> Genome Research. 23 (5), 800-811 (2013).</li><li>White, M. A., Myers, C. A., Corbo, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+in+vivo+enhancer+assay+reveals+that+highly+local+features+determine+the+cis+-regulatory+function+of+ChIP-seq+peaks.">Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis -regulatory function of ChIP-seq peaks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (29), 11952-11957 (2013).</li><li>Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+synthetic+promoter+assays+reveal+the+in+vivo+effects+of+binding+site+variants.">Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants.</a> Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).</li><li>Sch&#252;tze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).</li><li>Panne, D., Maniatis, T., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+model+of+the+interferon-beta+enhanceosome.">An atomic model of the interferon-beta enhanceosome.</a> Cell. 129 (6), 1111-1123 (2007).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

MPRA is a flexible and powerful tool for dissection of sequence-activity relationships in gene regulatory elements. The success of MPRA experiments depend on at least three factors: 1) careful design of the sequence library, 2) minimization of artifacts during amplification and cloning, and 3) high transfection efficiency. 
The possible lengths of the variable regions in the reporter constructs are largely determined by the synthesis or cloning technology used. Standard OLS is generally limited to about 200 nt, but this protocol is compatible with inserts up to at least 1,000 nt. Note that variable regions that are highly repetitive or contain strong secondary structures may end up underrepresented due to PCR and cloning biases. The length of the tags that identify each of the variable regions should be 10-20 nt and the collection of tags should ideally be designed such there are at least two nucleotide differences between any pair. Tags that contain the seed sequences of known microRNA or other factors that might influence mRNA stability should also be avoided when possible.
A key parameter in the design of MPRA experiments is the total number of distinct reporter constructs to be included in the library (the design complexity, denoted CD). In practice, CD is limited by the number of cultured cells that can be transfected. As a rule of thumb, the total number of transfected cells should be at least 50-100 times greater than CD. For example, if 20 million cells can be transfected with a transfection efficiency of 50%, then CD should be no more than ~200,000. Note that CD is equal to the number of distinct regulatory sequence variants multiplied by the number of distinct tags per sequence. The more distinct tags are linked to each regulatory sequence, the more accurate the estimate of the activity of that sequence can be made (because measurements from distinct tags can be averaged), but the fewer distinct variants can be assayed in one experiment. The optimal choice depends on the experimental design. In a simple &#8220;promoter bashing&#8221; experiment, where a mathematical model will be fitted to the aggregated measurements, a single tag per variant is usually sufficient. In a screen for single-nucleotide polymorphisms that cause changes in regulatory activities, it may be necessary to use 20 or more tags per allele to obtain statistically robust results, because comparing each pair of alleles requires a separate hypothesis test. 
If the sequences to be assayed are not expected to contain transcription start sites, a constant promoter can also be added in the same fragment. For example, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) includes a minimal TATA-box promoter that is useful when the upstream variable region is expected to have significant enhancer activity, while pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) includes a modified, strong SV40 viral promoter that is useful when the variable region is expected to contain silencer activity or other negative regulatory elements. 
Raw OLS products often contain a significant fraction of truncated oligonucleotides. These may interfere with accurate PCR amplification of the designed sequences, particularly when there is significant homology between them. Using PAGE purification to remove truncated synthesis products and emulsion PCR to minimize amplification artifacts are effective techniques for ensuring high library quality. If either step is impractical, it is imperative to minimize the number of PCR cycles used at each amplification step. Selection and expansion of the cloned library in liquid culture is generally sufficient to maintain the design complexity, but if recombination-prone vectors are to be used or significant representation bias is observed, the recovered cells can instead be plated directly onto large LB agar plates, expanded as individual colonies and then scraped off for DNA isolation. It is also important to consider the potential impact of synthesis errors, which are typically found at a rate of 1:100-500 in OLS. Full-length sequencing of the reporter constructs prior to transfection is recommended to identify and correct for such errors.
It is not necessary to introduce reporter constructs into every cell in the transfected culture, but transfection efficiencies below ~50% may lead to poor signal to noise ratios. It is advisable to optimize transfection conditions prior to performing MPRA experiments in a new cell type. When working with hard-to-transfect cell types, MPRA signals can be boosted by pre-selecting transfected cells. The pMPRA vector series includes variants that constitutively express a truncated cell surface marker that can be used to physically enrich for transfected cells prior to RNA isolation (for example, Addgene IDs 49350 and 49351).

A correction to the author list has been made for article <a href="http://www.jove.com/video/51719">Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells</a>.

Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

超並列レポーターアッセイ（MPRA）DNA配列1〜7の数十万人に何千もの転写調節活動の多重化された測定を可能にする。その最も一般的な実装では、多重化は、オープンリーディングフレーム（; 図1 ORF）の下流に識別するシーケンスタグを含む合成レポーター遺伝子に関心のある各シーケンスを結合することによって達成される。トランスフェクション、RNA単離およびレポーター遺伝子転写物の3 &#39;末端の深いシーケンシングの後、結合された配列の相対的活性は、それらの識別タグの相対存在量から推測することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> MPRAの図1。概要。MPRAレポーター構築物のライブラリーは、合成に推定される調節配列に結合することによって構築される（例えばGFP又はルシフェラーゼのような）「不活性」、ORFから成るレポーター遺伝子は、識別配列タグが続く。ライブラリーは、培養細胞の集団に一斉にトランスフェクトされ、転写レポーターmRNAはその後回収される。ディープシークエンシングは、レポーターmRNAおよびトランスフェクトプラスミドの間で、各タグの出現回数をカウントするために使用される。プラスミドカウント上のmRNAのカウントの比率が、対応する調節配列の活性を推測するために使用することができる。メルニコフの許可を得て適応さら 2。 MPRAは、対象の遺伝子座を横切っ新規調節エ​​レメントに対する個別の遺伝子調節要素の1）総合的突然変異誘発、2）スキャンを含む、実験デザインの多種多様に適合させることができる、3）推定上の一組の天然の遺伝的変異の効果を試験するプロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、合成調節要素の4）の半合理的なエンジニアリング。リー配列変異体のbrariesは、プログラマブルマイクロアレイ2,3,6,7、縮重オリゴヌクレオチド1,4のアッセンブリー、コンビナトリアルライゲーション8およびゲノムDNA 5の断片化に対するオリゴヌクレオチドライブラリー合成（OLS）を含む、さまざまな方法を用いて生成することができる。 （それぞれAddgene IDが49349と49352、; http://www.addgene.org）このプロトコルはOLSとpMPRA1とpMPRAdonor1ベクターを用いて、変異型プロモーターのライブラリーの構築について説明し、培養された哺乳動物細胞へのこのライブラリの一過性トランスフェクションおよびその後の定量それらに関連するタグ（タグ配列）の深い配列決定によるプロモーター活性の。このプロトコルの以前のバージョンでは、（2013）研究23、800から811メルニコフらネイチャー·バイオテクノロジー30、271-277（2012）およびKheradpour らゲノムに報告され、研究で使用した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="954">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:359px;">Oligonucleotide library synthesis</td>
			<td style="width:201px;">Agilent, CustomArray or other OLS vendors</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
			<td style="width:275px;">If using OLS construction method</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:359px;">pMPRA1</td>
			<td style="width:201px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">49349</td>
			<td>MPRA plasmid backbone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">pMPRAdonor1</td>
			<td style="width:201px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">49352</td>
			<td>luc2 ORF donor plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)</td>
			<td style="width:201px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>OLS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:359px;">Novex TBE-Urea Gels, 10%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">EC6875BOX</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Novex TBA-Urea Sample Buffer</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC6876</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Micellula DNA Emulsion &#38; Purification Kit</td>
			<td style="width:201px;">EURx/CHIMERx</td>
			<td style="width:119px;">3600-01</td>
			<td>Library amplification by emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td style="width:201px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600675</td>
			<td>Polymerase for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SfiI</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0123S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">XbaI</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0145S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C4040-50</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">LB agar and liquid media with carbenicllin</td>
			<td style="width:201px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Growth media for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">E-Gel EX Gels 1%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G4010-01</td>
			<td>Library verification and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">E-Gel EX Gels, 2%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G4010-02</td>
			<td>Library verification and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MinElute Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:201px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28604</td>
			<td>Library and backbone purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:201px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12362</td>
			<td>Library DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell culture media</td>
			<td style="width:201px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Experiment-specific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Transfection reagents</td>
			<td style="width:201px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Experiment-specific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MicroPoly(A)Purist Kit</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1919</td>
			<td>mRNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1907</td>
			<td>Plasmid DNA removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18080-051</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix</td>
			<td style="width:201px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600850</td>
			<td>Polymerase for Tag-Seq PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Primers (see text)</td>
			<td style="width:201px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
			<td>PAGE purify Tag-Seq primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

massively parallel reporter assays in cultured mammalian cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

MPRAは、高解像度、転写調節エレメントの配列 - 活性関係の定量的な切開を容易にする。成功MPRA実験は、一般的にトランスフェクトライブラリ（ 図3A）中の配列の大部分を再現性の高い測定結果が得られます。乏しい再現性（ 図3B）が観察される場合、これは、アッセイされた配列のうち、1）低い絶対活性、または2）低いトランスフェクション効率のいずれかに、回収されたRNA試料中のレポーターmRNAの低すぎる濃度の指標である。 図4は 1,2センダイウイルスへの曝露の有無にかかわらず、HEK293細胞におけるヒトIFNB遺伝子の上流145 bpの配列の〜37000のランダムな変異型を分析することによって生成された代表「情報フットプリント」を示しています。プロモーターTATAボックスと知られている近位エンハンサー10は、明らかに情報豊富なレジとして識別することができるウイルス依存的にアドオン。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> 図3。タグ配列の再現性。高い（A）と低（B）再現性を持つ2つの独立した複製のトランスフェクションからのタグ配列データの例を示す散布図。後者のプロットは、2つの複製の一方のみに高いmRNAのカウントを持つ多くの外れ値のタグを表示します。このような成果物は、一般的に、レポーターmRNAの濃度によるレポーター構築物のうち、低い絶対活動、または低トランスフェクション効率のいずれか、定量的PCR増幅のために低すぎることを示している。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> 人間IFNB転写開始部位および近位エンハンサーの図4の情報フットプリント。 </strオング&gt;人間IFNB遺伝子の上流145ヌクレオチド（nt）の地域の約37000のランダムな変異体は、（A）とし、センダイウイルスに（B）の露出せずにHEK293細胞にMPRAを使用してアッセイした。青いバーは、レポーター出力し、各位置のヌクレオチド間の相互情報を表示します。近位エンハンサーおよびTATAボックスは、ウイルス感染時に高い情報コンテンツの領域として際立っている。

Watch this Scientific Journal Video about Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

massively-parallel-reporter-assays-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K ビュー.  Broad Institute. The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

ビデオ: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

生物学

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

ミッションLentiPlexは、哺乳動物細胞ではshRNAライブラリースクリーニングをプールされた

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

培養細胞からの染色体の準備

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

培養中の細胞のための生存率アッセイ

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...