HCC4017とHBEC30KT細胞株は、親切にドクター·ジョンみんなの研究室によって提供されました。この作品は、李博士張にセシルH.とアイダ·グリーンファンドによってサポートされていました。

注意：放射能と協力しながら、実験者や周囲の汚染を避けるために適切な予防措置をとります。局所放射線安全指針以下のすべての廃棄物を捨てて。 細胞の調製<ol><li>密集度は、アッセイの日に80％-90％になるように3.5センチメートルプレートでシード細胞。 <ol><li>細胞のための密集度に播種する細胞の種類とその成長速度に依存することに注意してください。密集度は、ヘム測定の日に80％-90％になるよう日、種子細胞の一定数の試薬で細胞を処理します。 3.5センチメートルプレートから得られた細胞の数が不十分な場合、次のステップのように放射性ALA同量の6センチプレートを使用します。 注：それは個々のプレートを処理することが容易であるため、個々のプレートの使用が推奨されます。 </li></ol></li><li>ヘム測定前日、最終的なCに到達するために0.1〜0.3μCiの[14 C] 5-ALAと冷たいALAを追加放射性物質を扱うとバックインキュベーターにプレートを置くための作業領域フィットの各培養皿に20総ALAのμMのonc​​entration。理想的には、16時間の放射性ALAでインキュベートします。 注：放射性標識5-ALAは、細胞株の間で変化し得る必要。少なくとも100の毎分放射能のカウント（CPM）は、計数に関連する誤差を最小化するために必要とされます。これは、研究対象の細胞株に必要な[14 C] 5-ALAの最小量を決定することをお勧めします。ほとんどの実験では0.1〜0.3μCiのは、良好な測定を取得するのに十分です。冷たいALAの添加は任意です。 </li></ol> 2.ヘムの抽出<ol><li>氷の上で細胞培養皿を置き、放射能ワークのエリアに収まるようにそれらを取ります。 <ol><li>防爆フード全体の抽出および蒸発プロセスを実行します。保存されたエーテルは、爆発するおそれがありますので、中にエーテル保管しない、小さなボトル中にエーテルを使用し、残りの液体を蒸発させます1カ月以上のオープンボトル。それは非常に可燃性であるとして、火気、およびヒーターの近くにアセトンを使用しないでください。それは、組織培養プラスチックを溶解するように、ガラスボトル中の試薬を含むストアアセトン。 </li></ol></li><li>ピペットを用いて培地を吸引除去。 1×冷PBS 1mlで細胞を一度洗ってください。 PBSを吸引除去。 </li><li>プレートに1×冷PBSを1ml加え、ラバーポリスマンを用いてプレートの底に細胞を収集します。標識された予備冷却の2mlチューブに各プレートから採取した細胞を転送します。 2ミリリットルチューブ内のすべてのセルを収集します。 注：各プレートから細胞を掻き取るために、各プレート新鮮なラバーポリスマンを使用してください。各プレートのためにあなたは、4つの2ミリリットルチューブ、1.5mlチューブとシンチレーションバイアルを必要とするであろう。 </li><li> 4℃で1分間、15,000×gでスピン。 </li><li> 、ピペットを用いてPBSを取り出し、短いスピンを与え、残留PBSを削除します。 1×100μlのPBSで細胞を再懸濁し。細胞を再懸濁し、氷上に維持するための渦。 </li><li> 10＆を取ります＃956; lの氷1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアへのステップ5と転送からは、タンパク質濃度を測定しました。 注意：細胞溶解緩衝液を細胞に添加し、後のタンパク質濃度を測定するために氷の上に維持されるべきです。 </li><li> 4℃で30秒間、5,000×gでステップ5からの残り90μlのスピン。完全に200μlのピペットチップを使用してPBSを除去します。 </li><li>ヘムの抽出緩衝液300μl加え、各チューブに（材料リストを参照してください）​​。その後、15秒間渦が混在し、1分間氷上に置く、この3回繰り返します。 <ol><li>ヘム抽出バッファー（HEB）を追加し、ペレットを再懸濁するために迅速にチューブをボルテックス、ペレットが長すぎるためにHEBに放置されることなく、迅速に再懸濁する必要があるため、一度に1つまたは2つの管を行います。 HEBは、全てのチューブに添加し、ペレットを次に再懸濁した後、ペレットをするためのHEBバッファに残っている場合は、ペレットがHEBに完全に行かないことがステップ8ノートのように15秒の渦と氷のサイクルで1分間に従ってくださいより長いです時間とすぐに再懸濁していません。 </li></ol></li><li> 30秒間各チューブとボルテックスにジエチルエーテル1.2 mlを加え。 4℃で5分間、15,000×gでスピン。 注：ジエチルエーテルを迅速にピペットチップを使い果たしました。 、これを制御ピペットジエチルエーテル上下一度か二度するには、そうすることは、ピペットでジエチルエーテルを保持するのに役立ちます。この新鮮なピペットチップを使用するたびに繰り返します。 </li><li>新しいマイクロチューブに1ミリリットルピペットでトップ（エーテル）相を転送します。ステップ9のように2 N塩酸、混合するための渦とスピンの0.5ミリリットルを追加します。 注：これは、エーテルとHCl相の間の分離を参照してくださいすることは困難です。したがって、淡青色を与えるために十分な実験中に使用される2 N HCl溶液にトリパンブルーを少量加えます。これは、2つのフェーズを区別するのに役立ちます。下相が青色になり、上部のエーテル相が無色になります。新しいチューブに上層無色エーテル相を移し、下のHCl（青）相を廃棄します。 </li><li>手順10を繰り返し2複数回に2 N HClでエーテル相を洗浄します。各繰り返しの間に新しいチューブにのみトップエーテル相を移し、下のHCl相を廃棄します。 </li><li> HClで3回目の洗浄後、シンチレーションバイアルに1ミリリットルピペットで上相を転送します。化学フードO / Nでサンプルを維持することによってジエチルエーテルを蒸発させることにより、サンプルを乾燥させます。 </li></ol>放射能の測定3。 <ol><li>翌日、ステップ2.12から乾燥試料にシンチレーション液を5ml加えます。 </li><li>混合するためによく振って。シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定します。 </li></ol> 4.計算<ol><li>のCelLytic Mバッファの等量を用いて、ステップ2.6からの溶解は、細胞を4℃で5分間、14,000×gでスピン（材料リストを参照してください）​​。 </li><li>上清のアリコートを取り、BCAタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を測定します。 総mgの中のタンパク質の量（TP）=（90μlの*濃タンパク質の中81; G /μL）/千 ヘム合成レベル（放射能/ TP）=タンパク質のピコモル/ mgで。 </li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ヘムは、呼吸26を介して細胞エネルギーの生成に重要な役割を果たしています。変更されたヘム代謝、癌28,41を含む種々の疾患に関連することが知られています。ヘム合成の阻害は、Hela細胞26,41における細胞周期の停止およびアポトーシスを引き起こすことが知られています。これは、高いヘム合成レベルが肺癌細胞28の進行と関連していることが示されてい?...

ヘム、第一鉄とプロトポルフィリンIXの複合体は、事実上すべての生物1-3の酸素を運搬し、利用するための中心的な分子です。ヘムのユニークな構造は、二原子気体と電子のキャリアとして機能するだけでなく、様々な他の機能1-5を実行することが可能となります。例えば、ヘムは、酸素6,7の転送と記憶のためのヘモグロビンやミオグロビン中の酸素と結合します。また、チトクロームP450酵素により触媒される8,9レドックス反応のための電子供与体として、呼吸および動作中にシトクロムにおける電子キャリアとして機能します。ヘムの最も重要な特徴の一つは、そのような遺伝子転写、タンパク質合成およびマイクロRNAの生合成4などの細胞および分子プロセスにおいて調節の役割を果たし得る、ということです。例えば、哺乳動物の転写リプレッサーBACH1の活性および哺乳類核RECを制御することにより、多くの遺伝子の転写に影響を与えますeptor Rev非ERBα10-15。ヘムは、ヘムまたは酸素16に応答して、呼吸および酸化的損傷の制御に関与する遺伝子の活性化に重要な役割を果たしているヘム活性化タンパク質（HAP）1の活性化を調節します。ヘムも3,17-20シグナリング神経成長因子（NGF）を介して、神経細胞における遺伝子転写を調節します。また、ヘム調節eIF2αキナーゼ（HRI）21-24の活性を調節することによって、哺乳動物の赤血球細胞におけるタンパク質合成を調節します。また、ヘムは、適切な細胞の機能および細胞増殖4,20,25に必須であるようなチロシンキナーゼのJak2およびSrcなどの重要なシグナル伝達タンパク質の活性に影響を与えます。これは、HeLa細胞においてヘム阻害が老化およびアポトーシス26に関連するマーカーの細胞周期停止及び活性化を引き起こすことが見出されました。ヘム欠乏症やヘムのレベルの増加の両方が、ヒト27で深刻な健康への影響に関連しています。最近の分子AND疫学的研究は、高いヘム摂取の正の関連を示し、例えば、2型糖尿病、冠状動脈性心疾患および肺癌、結腸直腸癌および膵臓癌27,28を含むいくつかの癌のような疾患のリスクが増加しています。正常および癌性肺細胞の著者の研究室のペアを使用した癌細胞は、酸素消費量、ヘム合成やヘム取り込みおよび酸素利用率28に関与するタンパク質のレベルが増加していることを見出しました。興味深いことに、ヘム合成の阻害は、癌細胞28の酸素消費、増殖、移動およびコロニー形成を減少させました。したがって、内因性のヘムのレベルの変動は、分子及び細胞プロセス3,4,28,29の調節において重要な役割を果たしています。 哺乳類では、ヘムの生合成は、ミトコンドリア及び細胞質ゾル4（ 図1）内に位置する酵素を含む、8ステップで起こります。ヘムBIOSYN論文は、ALAシンターゼ（ALAS）4,31によって触媒5-アミノレブリン酸（5-ALA）を形成するグリシンとスクシニルCoAとの縮合を用いてミトコンドリアのマトリックスから始まります。これはnonerythroid細胞におけるヘム生合成の律速段階です。 5-ALAは、次の4つのステップが、再びそれはプロトポルフィリンIX（PPIX）に変換され、ミトコンドリアにインポートされるコプロポルフィリノーゲンIII（CPgenIII）を形成するために起こる細胞質ゾルに出てエクスポートされます。最後に、鉄の一分子はヘム、フェロケラターゼ（FECH）2,4によって触媒される反応を生成するためにプロトポルフィリンIX（PPIX）に組み込まれています。 ヘム生合成のレベルは、主にしっかりと細胞内の鉄とヘム4によって制御されるALAS酵素のレベルに依存します。ヘムの生合成は、特定のミネラルやビタミンの利用可能性（ 例えば、リボフラビン、亜鉛）、毒素への曝露（ 例えば、アルミニウム、鉛、遺伝的欠陥によって影響を受ける可能性があります）、無酸素、熱、および特定のステロイドのレベル（ 例えば、エストロゲン）32-35。ヘム合成のレベルは、種々の疾患状態に変更されます。ヘム生合成は、貧血などの神経疾患3,36を引き起こす可能性が減少しました。あるいは、増加したヘム生合成は、特定の癌28,37の進行に重要な役割を果たしています。ヘムは、哺乳動物の脂肪、赤血球および神経細胞4,38-41の増殖、分化および生存のために重要であることが示されています。例えば、ヘムの欠乏はグルタミン酸NMDA（N -メチル-D-アスパラギン酸）受容体17の阻害を介して一次マウス皮質ニューロンにおける神経損傷につながります。さらに、ヘム合成の阻害は、ヒト上皮頸癌HeLa細胞におけるプログラム細胞死26,41を引き起こします。そのため、異なる条件下で種々の細胞におけるヘム生合成のレベルを測定することは病因とprogressiを研究するために重要です多くの疾患の上。 ここでは、[4- 14 C] 5-aminolevulic酸を用いて細胞内のヘム合成のレベルを測定するための迅速かつ高感度な方法を説明します。これは55のFeまたは59のFeを使用して他の方法に代わる方法です。私たちは、その放射線が非常に弱いため、14 Cを使用して好みます。これとは対照的に、強力な保護は、Feの同位体での作業のために必要とされます。さらに、この方法は、迅速な方法で並行して異なるセル内のヘム合成を測定し、比較することを意図しています。絶対ヘム濃度を測定するためには、HPLC 42,43の使用を伴う以前に確立された方法を使用してもよいです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

ヘムは、ヘモグロビン、ミオグロビン、およびチトクロームのようなヘムタンパク質として知られている多種多様なタンパク質のための補欠分子族として機能します。このような遺伝子の転写、翻訳、細胞分化および細胞増殖などの種々の分子との細胞プロセスに関与しています。ヘムの生合成レベルは、異なる組織および細胞型間で異なると、そのような貧血、神経障害および癌などの疾患状態に変更されます。この技術は、[4- 14 C] 5-アミノレブリン酸（[14 C] 5-ALA）、哺乳動物細胞においてヘム合成のレベルを測定するためのヘム生合成経路における早期の前駆体の1つを使用します。このアッセイは、[14 C]ヘムおよびヘムに取り込まれた放射能の測定を抽出した5-ALAとの細胞のインキュベーションを含みます。この手順は、正確かつ迅速です。この方法は、ヘム生合成の相対的レベルではなく、総ヘム含量を測定します。このTECHNの使用を実証するために、ヘム生合成のレベルのiQueいくつかの哺乳動物細胞株において測定しました。

この方法は、癌（HCC4017）肺細胞対（HBEC30KT）正常でヘム合成のレベルを比較した。 図2は 、正常肺細胞（HBEC30KT）よりも癌細胞（HCC4017）においてヘム合成のより高いレベルを示しています。ヘム合成のレベルはまた、ミトコンドリアの脱共役カルボニルシアニド3-クロロフェニル（CCCP）の存在下で、正常細胞と癌細胞で測定しました。細胞は、ヘム合成のレベルを測定する前に24...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.0K ビュー.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.