HCC4017とHBEC30KT細胞株は、親切にドクター·ジョンみんなの研究室によって提供されました。この作品は、李博士張にセシルH.とアイダ·グリーンファンドによってサポートされていました。

注意：放射能と協力しながら、実験者や周囲の汚染を避けるために適切な予防措置をとります。局所放射線安全指針以下のすべての廃棄物を捨てて。 細胞の調製<ol><li>密集度は、アッセイの日に80％-90％になるように3.5センチメートルプレートでシード細胞。 <ol><li>細胞のための密集度に播種する細胞の種類とその成長速度に依存することに注意してください。密集度は、ヘム測定の日に80％-90％になるよう日、種子細胞の一定数の試薬で細胞を処理します。 3.5センチメートルプレートから得られた細胞の数が不十分な場合、次のステップのように放射性ALA同量の6センチプレートを使用します。 注：それは個々のプレートを処理することが容易であるため、個々のプレートの使用が推奨されます。 </li></ol></li><li>ヘム測定前日、最終的なCに到達するために0.1〜0.3μCiの[14 C] 5-ALAと冷たいALAを追加放射性物質を扱うとバックインキュベーターにプレートを置くための作業領域フィットの各培養皿に20総ALAのμMのonc​​entration。理想的には、16時間の放射性ALAでインキュベートします。 注：放射性標識5-ALAは、細胞株の間で変化し得る必要。少なくとも100の毎分放射能のカウント（CPM）は、計数に関連する誤差を最小化するために必要とされます。これは、研究対象の細胞株に必要な[14 C] 5-ALAの最小量を決定することをお勧めします。ほとんどの実験では0.1〜0.3μCiのは、良好な測定を取得するのに十分です。冷たいALAの添加は任意です。 </li></ol> 2.ヘムの抽出<ol><li>氷の上で細胞培養皿を置き、放射能ワークのエリアに収まるようにそれらを取ります。 <ol><li>防爆フード全体の抽出および蒸発プロセスを実行します。保存されたエーテルは、爆発するおそれがありますので、中にエーテル保管しない、小さなボトル中にエーテルを使用し、残りの液体を蒸発させます1カ月以上のオープンボトル。それは非常に可燃性であるとして、火気、およびヒーターの近くにアセトンを使用しないでください。それは、組織培養プラスチックを溶解するように、ガラスボトル中の試薬を含むストアアセトン。 </li></ol></li><li>ピペットを用いて培地を吸引除去。 1×冷PBS 1mlで細胞を一度洗ってください。 PBSを吸引除去。 </li><li>プレートに1×冷PBSを1ml加え、ラバーポリスマンを用いてプレートの底に細胞を収集します。標識された予備冷却の2mlチューブに各プレートから採取した細胞を転送します。 2ミリリットルチューブ内のすべてのセルを収集します。 注：各プレートから細胞を掻き取るために、各プレート新鮮なラバーポリスマンを使用してください。各プレートのためにあなたは、4つの2ミリリットルチューブ、1.5mlチューブとシンチレーションバイアルを必要とするであろう。 </li><li> 4℃で1分間、15,000×gでスピン。 </li><li> 、ピペットを用いてPBSを取り出し、短いスピンを与え、残留PBSを削除します。 1×100μlのPBSで細胞を再懸濁し。細胞を再懸濁し、氷上に維持するための渦。 </li><li> 10＆を取ります＃956; lの氷1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアへのステップ5と転送からは、タンパク質濃度を測定しました。 注意：細胞溶解緩衝液を細胞に添加し、後のタンパク質濃度を測定するために氷の上に維持されるべきです。 </li><li> 4℃で30秒間、5,000×gでステップ5からの残り90μlのスピン。完全に200μlのピペットチップを使用してPBSを除去します。 </li><li>ヘムの抽出緩衝液300μl加え、各チューブに（材料リストを参照してください）​​。その後、15秒間渦が混在し、1分間氷上に置く、この3回繰り返します。 <ol><li>ヘム抽出バッファー（HEB）を追加し、ペレットを再懸濁するために迅速にチューブをボルテックス、ペレットが長すぎるためにHEBに放置されることなく、迅速に再懸濁する必要があるため、一度に1つまたは2つの管を行います。 HEBは、全てのチューブに添加し、ペレットを次に再懸濁した後、ペレットをするためのHEBバッファに残っている場合は、ペレットがHEBに完全に行かないことがステップ8ノートのように15秒の渦と氷のサイクルで1分間に従ってくださいより長いです時間とすぐに再懸濁していません。 </li></ol></li><li> 30秒間各チューブとボルテックスにジエチルエーテル1.2 mlを加え。 4℃で5分間、15,000×gでスピン。 注：ジエチルエーテルを迅速にピペットチップを使い果たしました。 、これを制御ピペットジエチルエーテル上下一度か二度するには、そうすることは、ピペットでジエチルエーテルを保持するのに役立ちます。この新鮮なピペットチップを使用するたびに繰り返します。 </li><li>新しいマイクロチューブに1ミリリットルピペットでトップ（エーテル）相を転送します。ステップ9のように2 N塩酸、混合するための渦とスピンの0.5ミリリットルを追加します。 注：これは、エーテルとHCl相の間の分離を参照してくださいすることは困難です。したがって、淡青色を与えるために十分な実験中に使用される2 N HCl溶液にトリパンブルーを少量加えます。これは、2つのフェーズを区別するのに役立ちます。下相が青色になり、上部のエーテル相が無色になります。新しいチューブに上層無色エーテル相を移し、下のHCl（青）相を廃棄します。 </li><li>手順10を繰り返し2複数回に2 N HClでエーテル相を洗浄します。各繰り返しの間に新しいチューブにのみトップエーテル相を移し、下のHCl相を廃棄します。 </li><li> HClで3回目の洗浄後、シンチレーションバイアルに1ミリリットルピペットで上相を転送します。化学フードO / Nでサンプルを維持することによってジエチルエーテルを蒸発させることにより、サンプルを乾燥させます。 </li></ol>放射能の測定3。 <ol><li>翌日、ステップ2.12から乾燥試料にシンチレーション液を5ml加えます。 </li><li>混合するためによく振って。シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定します。 </li></ol> 4.計算<ol><li>のCelLytic Mバッファの等量を用いて、ステップ2.6からの溶解は、細胞を4℃で5分間、14,000×gでスピン（材料リストを参照してください）​​。 </li><li>上清のアリコートを取り、BCAタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を測定します。 総mgの中のタンパク質の量（TP）=（90μlの*濃タンパク質の中81; G /μL）/千 ヘム合成レベル（放射能/ TP）=タンパク質のピコモル/ mgで。 </li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ヘムは、呼吸26を介して細胞エネルギーの生成に重要な役割を果たしています。変更されたヘム代謝、癌28,41を含む種々の疾患に関連することが知られています。ヘム合成の阻害は、Hela細胞26,41における細胞周期の停止およびアポトーシスを引き起こすことが知られています。これは、高いヘム合成レベルが肺癌細胞28の進行と関連していることが示されてい?...

ヘム、第一鉄とプロトポルフィリンIXの複合体は、事実上すべての生物1-3の酸素を運搬し、利用するための中心的な分子です。ヘムのユニークな構造は、二原子気体と電子のキャリアとして機能するだけでなく、様々な他の機能1-5を実行することが可能となります。例えば、ヘムは、酸素6,7の転送と記憶のためのヘモグロビンやミオグロビン中の酸素と結合します。また、チトクロームP450酵素により触媒される8,9レドックス反応のための電子供与体として、呼吸および動作中にシトクロムにおける電子キャリアとして機能します。ヘムの最も重要な特徴の一つは、そのような遺伝子転写、タンパク質合成およびマイクロRNAの生合成4などの細胞および分子プロセスにおいて調節の役割を果たし得る、ということです。例えば、哺乳動物の転写リプレッサーBACH1の活性および哺乳類核RECを制御することにより、多くの遺伝子の転写に影響を与えますeptor Rev非ERBα10-15。ヘムは、ヘムまたは酸素16に応答して、呼吸および酸化的損傷の制御に関与する遺伝子の活性化に重要な役割を果たしているヘム活性化タンパク質（HAP）1の活性化を調節します。ヘムも3,17-20シグナリング神経成長因子（NGF）を介して、神経細胞における遺伝子転写を調節します。また、ヘム調節eIF2αキナーゼ（HRI）21-24の活性を調節することによって、哺乳動物の赤血球細胞におけるタンパク質合成を調節します。また、ヘムは、適切な細胞の機能および細胞増殖4,20,25に必須であるようなチロシンキナーゼのJak2およびSrcなどの重要なシグナル伝達タンパク質の活性に影響を与えます。これは、HeLa細胞においてヘム阻害が老化およびアポトーシス26に関連するマーカーの細胞周期停止及び活性化を引き起こすことが見出されました。ヘム欠乏症やヘムのレベルの増加の両方が、ヒト27で深刻な健康への影響に関連しています。最近の分子AND疫学的研究は、高いヘム摂取の正の関連を示し、例えば、2型糖尿病、冠状動脈性心疾患および肺癌、結腸直腸癌および膵臓癌27,28を含むいくつかの癌のような疾患のリスクが増加しています。正常および癌性肺細胞の著者の研究室のペアを使用した癌細胞は、酸素消費量、ヘム合成やヘム取り込みおよび酸素利用率28に関与するタンパク質のレベルが増加していることを見出しました。興味深いことに、ヘム合成の阻害は、癌細胞28の酸素消費、増殖、移動およびコロニー形成を減少させました。したがって、内因性のヘムのレベルの変動は、分子及び細胞プロセス3,4,28,29の調節において重要な役割を果たしています。 哺乳類では、ヘムの生合成は、ミトコンドリア及び細胞質ゾル4（ 図1）内に位置する酵素を含む、8ステップで起こります。ヘムBIOSYN論文は、ALAシンターゼ（ALAS）4,31によって触媒5-アミノレブリン酸（5-ALA）を形成するグリシンとスクシニルCoAとの縮合を用いてミトコンドリアのマトリックスから始まります。これはnonerythroid細胞におけるヘム生合成の律速段階です。 5-ALAは、次の4つのステップが、再びそれはプロトポルフィリンIX（PPIX）に変換され、ミトコンドリアにインポートされるコプロポルフィリノーゲンIII（CPgenIII）を形成するために起こる細胞質ゾルに出てエクスポートされます。最後に、鉄の一分子はヘム、フェロケラターゼ（FECH）2,4によって触媒される反応を生成するためにプロトポルフィリンIX（PPIX）に組み込まれています。 ヘム生合成のレベルは、主にしっかりと細胞内の鉄とヘム4によって制御されるALAS酵素のレベルに依存します。ヘムの生合成は、特定のミネラルやビタミンの利用可能性（ 例えば、リボフラビン、亜鉛）、毒素への曝露（ 例えば、アルミニウム、鉛、遺伝的欠陥によって影響を受ける可能性があります）、無酸素、熱、および特定のステロイドのレベル（ 例えば、エストロゲン）32-35。ヘム合成のレベルは、種々の疾患状態に変更されます。ヘム生合成は、貧血などの神経疾患3,36を引き起こす可能性が減少しました。あるいは、増加したヘム生合成は、特定の癌28,37の進行に重要な役割を果たしています。ヘムは、哺乳動物の脂肪、赤血球および神経細胞4,38-41の増殖、分化および生存のために重要であることが示されています。例えば、ヘムの欠乏はグルタミン酸NMDA（N -メチル-D-アスパラギン酸）受容体17の阻害を介して一次マウス皮質ニューロンにおける神経損傷につながります。さらに、ヘム合成の阻害は、ヒト上皮頸癌HeLa細胞におけるプログラム細胞死26,41を引き起こします。そのため、異なる条件下で種々の細胞におけるヘム生合成のレベルを測定することは病因とprogressiを研究するために重要です多くの疾患の上。 ここでは、[4- 14 C] 5-aminolevulic酸を用いて細胞内のヘム合成のレベルを測定するための迅速かつ高感度な方法を説明します。これは55のFeまたは59のFeを使用して他の方法に代わる方法です。私たちは、その放射線が非常に弱いため、14 Cを使用して好みます。これとは対照的に、強力な保護は、Feの同位体での作業のために必要とされます。さらに、この方法は、迅速な方法で並行して異なるセル内のヘム合成を測定し、比較することを意図しています。絶対ヘム濃度を測定するためには、HPLC 42,43の使用を伴う以前に確立された方法を使用してもよいです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

ヘムは、ヘモグロビン、ミオグロビン、およびチトクロームのようなヘムタンパク質として知られている多種多様なタンパク質のための補欠分子族として機能します。このような遺伝子の転写、翻訳、細胞分化および細胞増殖などの種々の分子との細胞プロセスに関与しています。ヘムの生合成レベルは、異なる組織および細胞型間で異なると、そのような貧血、神経障害および癌などの疾患状態に変更されます。この技術は、[4- 14 C] 5-アミノレブリン酸（[14 C] 5-ALA）、哺乳動物細胞においてヘム合成のレベルを測定するためのヘム生合成経路における早期の前駆体の1つを使用します。このアッセイは、[14 C]ヘムおよびヘムに取り込まれた放射能の測定を抽出した5-ALAとの細胞のインキュベーションを含みます。この手順は、正確かつ迅速です。この方法は、ヘム生合成の相対的レベルではなく、総ヘム含量を測定します。このTECHNの使用を実証するために、ヘム生合成のレベルのiQueいくつかの哺乳動物細胞株において測定しました。

この方法は、癌（HCC4017）肺細胞対（HBEC30KT）正常でヘム合成のレベルを比較した。 図2は 、正常肺細胞（HBEC30KT）よりも癌細胞（HCC4017）においてヘム合成のより高いレベルを示しています。ヘム合成のレベルはまた、ミトコンドリアの脱共役カルボニルシアニド3-クロロフェニル（CCCP）の存在下で、正常細胞と癌細胞で測定しました。細胞は、ヘム合成のレベルを測定する前に24...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K ビュー.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

生物学

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

瓜沙手続におけるヘムオキシゲナーゼ-1アップレギュレーションの生物発光イメージング

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

ミッションLentiPlexは、哺乳動物細胞ではshRNAライブラリースクリーニングをプールされた

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.