まず、層流フードに配置されたピペットステーションのパラメータを1パルスで1, 900ボルト、20ミリ秒に設定します。トランスフェクションチューブをパッケージから慎重に取り出して無菌状態に保ち、3 mmリットルのEバッファーを充填します。エレクトロポレーションのために細胞を調製するには、細胞から増殖培地を取り除き、PBSを使用して細胞を洗浄し、接着を促進する血清と二価の陽イオンを除去します。
次に、PBSと1ミリモルEDTAの混合物を細胞に加え、細胞が剥離し始めるまで室温で約5分間インキュベートします。ピペットで静かに上下に動かして細胞を剥離し、細胞をタンパク質吸着性の低い15ミリリットルのチューブに移します。細胞を500Gで5分間ペレット化します。
遠心分離後、上清の大部分を速やかに除去し、チューブ内に約1ミリリットルの上清を残します。残りの上清に細胞を再懸濁し、タンパク質吸着性の低い1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。少量の細胞を除去してカウントし、室温で500 Gで5分間遠心注入することにより、残りの細胞をペレット化します。
遠心分離中に細胞をカウントします。1x sgRNA を 20 ミリモルの Cas9 溶液に含み、チューブを室温まで温めます。遠心分離後、細胞ペレットから上清をすべて除去し、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを4,000万細胞/ミリリットルの濃度でPBSに再懸濁します。
sgRNA Cas9 リボ核タンパク質複合体アセンブリーでは、滅菌した PCR チューブ内の希釈した Cas9 1 マイクロリットルに 2.5 マイクロリットルの sgRNA を加え、沈殿を防ぐために約 15 秒間混合しながら sgRNA をゆっくりと分注します。室温で5分間インキュベートし、リボ核タンパク質複合体を形成します。エレクトロポレーションによってリボ核タンパク質複合体を送達するには、プランジャーを押し下げてステムを伸ばしてエレクトロポレーションチップを準備します。
次に、茎を先端に挿入します。ピペッティングで上下させて細胞を再懸濁します。エレクトロポレーションチップにセルをロードし、チップの容量10マイクロリットルをすべて引き出します。
ネガティブコントロールのsgRNAから始めて、エレクトロポレーションチップ内の10マイクロリットルの細胞を、3.5マイクロリットルのリボ核タンパク質を含むサンプルチューブに移します。ピペットを上下に3回動かしてよく混ぜ、10マイクロリットルの混合物をチップに戻します。チップをエレクトロポレーションステーションに入れ、バッファーに下げて、タッチスクリーンディスプレイのStartを押します。
完了すると、ディスプレイにパルスが成功したことが示されます。ピペットをデバイスから取り外し、細胞をコーティングされていない12ウェルプレートのドライウェルに入れます。塩化カルシウムと塩化マグネシウムを含む15ミリリットルのPBSで2回ピペッティングしてチップをすすぎます。
チップを取り付けたままピペットを脇に置いておきます。すぐに、先ほど分注した抗生物質を含まない培地1ミリリットルを細胞に加え、プレートを静かに振って混合します。ここでは、制御された非標的 sgRNA、Cas9 リボ核タンパク質、Rosa 26 特異的 sgRNA、および編集したマクロファージの Src および Cblb 遺伝子でエレクトロポレーションした骨髄由来マクロファージ由来の Rosa 26 遺伝子座の代表的な Sanger シーケンシングクロマトグラムを示します。
PCRおよびサンガーシーケンシングによる標的遺伝子の解析により、Cas9切断部位の下流の各位置に複数のヌクレオチドが示されました。これらの結果は、複数の標的遺伝子に対して高い編集効率を達成していることを実証しています。
