まず、6ウェルプレートにDAKIKI細胞を1ウェルあたり600万個の密度で播種します。さまざまな実験グループを設定し、対応する処理後、グループ化方法に基づいて、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。DAKIKI細胞からtotal RNAを抽出します。これは、total RNA extraction kitの指示に従って行います。
サンプルの各グループから抽出したRNAを1マイクロリットル取り出して、その濃度を測定します。キットの指示に従って、各サンプルから1マイクログラムの全RNAを相補的DNAに逆転写します。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、またはRT-PCR増幅を行い、各遺伝子の発現を検出します。
最初の24時間インキュベーション後のウェスタンブロッティングでは、各グループから細胞を回収します。採取した細胞に適量の細胞溶解液を加えてから、氷上で30分間インキュベートします。サンプルを13、500gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を収集してさらに分析します。
5X SDS-PAGEローディングバッファーでタンパク質サンプルを4対1の比率でボルテックスし、混合サンプルを摂氏100度で5分間加熱して、電気泳動前にタンパク質を変性させます。ランが完了したら、ゲルをPVDFメンブレンに移します。メンブレンを塞ぐには、5%脱脂乳に室温で2時間インキュベートします。
次に、β-アクチン抗体を内部コントロールとして使用しながら、対応する一次抗体とメンブレンを24時間インキュベートします。続いて、メンブレンを対応する二次ヤギ抗ウサギIgG抗体と室温で2時間インキュベートします。最後に、タンパク質バンド検出のための適切な量の増強化学発光ワーキング溶液でメンブレンを処理します。
定量的RT-PCRの結果から、モデル群のDAKIKI細胞では、C1GalT1とCoscの相対的なmRNA発現が対照群と比較して低下していることが示されました。Dioscinは、モデル群と比較して、2つの異なる学位の相対的なmRNAをアップレギュレーションしました。また、ウェスタンブロッティングの結果では、モデル群のDAKIKI細胞におけるC1GalT1およびCosmcのタンパク質発現が対照群と比較して減少することが示されました。
タンパク質の発現は、ジオシンの介入後にアップレギュレーションされました。
