このプロトコルは、ヒト用途に対して容易に修飾できる潜在的に新しい治療戦略を記述する。この技術は、末梢リンパ組織における腸ホーミング調節T細胞の誘導を直接増強し、高炎症性環境においても安定的に実施することができる。これらの技術は、末梢免疫系における活性ビタミンDおよびビタミンAの役割を調べるためにも使用することができる。
この視覚的なデモンストレーションでは、この技術の成功に不可欠な高品質の設計樹状細胞の生成のためのステップバイステップの手順を提供します。CM-10-D細胞培養培地中の7個の293T細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素で24時間培養する25ミリメートル培養プレートで1回10〜7回播種することから始めます。翌日、調製したての2倍の濃縮HBS溶液1.62ミリリットル、エンベローププラスミド9.5マイクログラム、包装プラスミド17.5マイクログラム、LENTI-CYP-ALDHプラスミド27マイクログラムを50ミリリットルの円錐チューブに加えます。
チューブ内容物の最終容積は、水で最大3.0375ミリリットル、続いて202.5マイクロリットルの塩化モル酸モル酸モルカルシウムを添加します。DNA沈殿混合物を室温で20分間放置し、時折混合してから、293T培養ごとに3.24ミリリットルの溶液を滴下し、皿を穏やかに渦巻きます。各プレートをPBSで静かに洗浄し、CM-4-D培養培地で細胞を供給する前に、プレートをインキュベーターに24時間置きます。
さらに24時間培養した後、上澄み物を摂氏4〜8度で貯蔵するために滅菌ボトルに収穫し、さらに24時間新鮮なCM-4-D培地で細胞を供給する。4日目に、再び上清を収穫し、3日と4日目の両方から上清を0.45マイクロメートルフィルターにひずみます。次いで、VSV-G擬似型ウイルスを遠心分離により24時間濃縮する。
翌日、上清をデカントします。チューブを無菌バイオセーフティキャビネットのペーパータオルで数分間排出させ、培養皿あたり5%グリセロールを含む滅菌PBSの33.3マイクロリットルでペレットを再懸濁させます。骨髄由来樹状細胞生成のために、BALB/cマウスから採取したチビアスおよび大腿骨を、新鮮な培養培地を含む100x20ミリメートルの培養皿に入れる。
骨から組織を取り除くためにはさみや鉗子を解剖してください。すべての骨が洗浄されたら、はさみを使用して各骨の両端を切断して骨髄腔を露出します。30ゲージの針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、各骨を10ミリリットルの新鮮な培養培地で洗い流し、骨髄を15ミリリットルのチューブに集めます。
骨髄の全てが採取されると、遠心分離によって骨髄を沈下し、2ミリリットルの赤血球リシスバッファーでペレットを再懸濁する。時折揺れで室温で4〜5分後、10ミリリットルの細胞培養培地で反応を停止し、遠心分離によって細胞を収集する。カウント用の10ミリリットルのCM-10-R培地中のペレットを再懸濁し、CM-10-R培地濃度のミリリットル当たり6個の細胞に10回調整した。
次に、組換えマウスGM-CSFの1ミリリットル当たり100単位、IL-4のミリリットル当たり10単位を細胞に加える。4ミリリットルの細胞を6つのウェル培養プレートの個々の井戸にプレートし、摂氏37度でインキュベーションし、5%の二酸化炭素を48時間加熱します。インキュベーションの終わりに、非接着性細胞を穏やかに吸引する。
細胞を細胞培養インキュベーターに48時間戻す前に、GM-CSFおよびIL-4を添加した新鮮な培地を培養物に加える。第2インキュベーションの終わりに、非粘着性骨髄由来樹状細胞を50ミリリットル円錐形のチューブに収穫して遠心分離を行う。BMDC-CYP-ALDH細胞を生成するには、CM-10-R培地1ウェル濃度当たり500マイクロリットル当たり10倍から6番目の樹状細胞の10倍の培養を再中断し、500マイクロリットルの細胞を新しい6つのウェル培養プレートの各ウェルウェルにプレートします。
LENTI-CYP-ALDHウイルスの50マイクロリットルとプロタミンのミリリットルあたり8マイクログラムを各ウェルに加え、24時間インキュベーターにプレートを置きます。翌日、上清を新鮮な培養培地に置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターにさらに24時間戻します。第2インキュベーションの終わりに、細胞は機能分析のために収穫前に24時間、1ウェルあたり1ミリリットル当たり100ナノグラムで活性化することができる。
親の骨髄由来樹状細胞と比較して、BMDC-CYP-ALDH細胞は1-α-ヒドロキシラーゼの増強された発現を示す。BMDC-CYPおよびBMDC-CYP-ALDH細胞の培養上清におけるビタミンDの活性型の濃度は、親骨髄由来樹状細胞およびBMDC-ALDH細胞培養において観察されたものよりも約20倍高い。基質で処理されたBMDC-CYP-ALDH細胞の平均蛍光強度は、基質で処理された親の骨髄由来樹状細胞の約6倍高い。
これは、BMDC-CYP-ALDH細胞が著しく増強されたレチナルデヒデヒドロゲナーゼ-2酵素活性を発現することを示唆している。25-ヒドロキシビタミンDおよびレチナルで処理されたDC2.4細胞は、foxp3陽性CCR9陽性CD4陽性T細胞の存在量に有意な変化を誘発しない。対照的に、25-ヒドロキシビタミンDおよびレチナルで処理されたDC2.4 CYP-ALDH細胞は、濃度依存的な方法で有意に高い数の腸ホーミング調節T細胞を誘導する。
また、腹腔内に注入された対照細胞と比較して、DC CYP-ALDH細胞はまた、BALB/cレシピエント動物への腹腔内注射後にfoxp3陽性CCR9陽性CD4陽性T細胞の数の有意な増加を誘導する。手順の成功は、健康なT細胞および正しく調製されたDNA混合物の調製に依存する。
