このプロトコルは、細胞が所定のサイトカインを産生する微小環境を視覚化することを可能にするので、重要であり、ここで、インターフェロンガンマを生成する。組織が非常に複雑であるため、サイトカインの作用範囲は限られていることが認められた。インターフェロンガンマ産生細胞を取り囲む細胞を特徴付けて、どの細胞がそれを取り上げるかを特定することが重要です。
この技術の主な利点は、目的の組織に存在する微小環境を破壊しないことである。また、人工的に細胞を再刺激してインターフェロンガンマを作り出すわけではないため、細胞が実際にインターフェロンガンマをその場で積極的に産生しているかどうかの特徴付けが向上します。このプロトコルは、他の器官や他のサイトカインの可視化のために適応される可能性がある。
このプロトコルの手順のほとんどは簡単ですが、組織の取り扱い、凍結および切片は、組織の完全性を維持するために注意して行われるべきです。まず、遺伝子組み換え培養した300マイクロリットルのLMを、フラスコで37°Cの摂氏で培養したブロス心液に移す。OD600が0.08から0.1に達するまで、LMを指数位相に成長させるために穏やかな攪拌のためにシェーカーの上にフラスコを置きます。
PBS中のLM OVA培養を0.1倍の致死量の濃度に希釈した後、50%は29ゲージのインスリン注射器を使用して、OT1 GFPまたはOT1 RFP細胞を有するC57黒6野生型マウスレシピエントに100マイクロリットルを静脈内に注入する。マウスの犠牲の6時間前にサイトカイン分泌を遮断するには、29ゲージインスリン注射器で腹腔内に250マイクログラムのBFAと200マイクロリットルのPBSを注入する。二酸化炭素とその後の子宮頸部脱臼を用いてマウスを安楽死させた後、70%エタノールで腹部を浄化する。
脾臓があるマウスの左脇腹で、はさみで皮膚を切り取り、1〜2センチメートルの切開を行います。その後、腹膜を慎重に切開して脾臓を露出させ、ピンセットで取り出します。脾臓アーキテクチャを混乱させないように、鉗子で絞ったりカットしたりしないように注意してください。
さて、PBSの3.75ミリリットルと0.2モルLリジンの3.75ミリリットルを混合することによって固定液を調製する。21ミリグラムのナトリウムm-歯を加え、よく混ぜます。その後、2.5ミリリットルの4%PFAと20マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウムを加えます。
脾臓を3つの部分に切ります。6ウェルプレートに固定剤に脾臓を沈め、最低4時間固定します。典型的な固定期間は、穏やかな攪拌の下で摂氏4度で16〜20時間である。
その後、固定液を捨て、穏やかな攪拌の下で室温で5分間PBSを5ミリリットル加えます。次いで、PBSを30%スクロースの5ミリリットルに置き換え、組織形態を維持するために12〜24時間インキュベートする。さて、オルガンはプレートの底に沈みます。
サンプルを凍結するには、大きなレセプタクルにドライアイスを入れ、約50ミリリットルの純粋なメタノールと数個のドライアイスを含む小さなレセプタクルを内部に入れます。糸くずのない拭き取りで脾臓を軽く乾かします。ベースモールドの底部にOCT化合物の滴を滴下し、金型の内側に脾臓を配置します。
気泡を出さないように注意してください。脾臓の上にOCTの約1ミリリットルを加えます。鉗子を使用して、メタノールの表面に基金型をドライアイスバスに堆積させ、メタノールがOCTに触れないようにします。
OCT は凍結すると厚くなり、白くなります。アーティファクトを最小限に抑えるために、できるだけ迅速に組織を凍結することを忘れないでください。クライオミクロトームで、マイナス20度の温度に設定します。
所望の厚さに組織を切り離し、10マイクロメートル前後。ブラシを使用して、ガラス顕微鏡スライドに切片を集め、視覚的に検査します。セクションを室温に戻します。
10 月の外側の組織セクションの周りに、たとえば PAP ペンなどの液体ブロッカーで円を描きます。組織が乾燥したら、組織セクションに100マイクロリットルのPBSを5分間滴下してサンプルを水分補給する。次に、吸引によってセクションからPBSを取り除き、サンプルセクションごとに100マイクロリットルのブロッキング溶液を加えます。
覆われた湿った部屋で室温で最低1時間インキュベートする。一次抗体で染色するには、ブロッキング溶液をサンプルごとに調製した一次抗体ミックスに置き換えます。原稿によると、洗浄する前に、室温で4時間、または覆われた湿った部屋で摂氏4度で一晩インキュベートします。
さて、目的の二次抗体を最適な濃度(通常は1ミリリットル当たり2.5マイクログラム)に希釈し、ブロッキング溶液に入れます。セクションから最終的な洗浄液を取り出し、準備した二次抗体ミックスをセクションの上に加え、覆われた湿ったチャンバーの室温で1〜4時間インキュベートします。原稿に記載の洗浄バッファーで洗浄した後、洗浄液を取り出し、PBSで最終洗浄を行う。
リン酸緩衝生理食塩水を吸引し、残りのPBSが完全に乾燥することなく蒸発させる。スライドの裏にあるセクションの周りに円を描きます。次に、サンプルの上に取り付け媒体の一滴を置き、媒体がセクション全体を覆っていることを確認し、慎重にカバーガラスを上に置きます。
サンプルポリメラーゼを暗闇の中で室温で一晩おきます。午前中、反転したスペクトルレーザー走査顕微鏡の下にスライドを置きます。サイトカイン細胞内局在の分析のために、目的を10x NA 0.40または60x NA 1.4に調整します。
このプロトコルでは、インターフェロンガンマを生成するセルが視覚化され、位置付けされます。マーカーF4/80はすべてのマクロファージにラベルを付け、赤いパルプを強調します。マーカーB220はB細胞にラベルを付け、T細胞ゾーンを囲むB細胞卵胞を強調する。
マーカーCD169は、白いパルプを囲む限界領域マクロファージを標識する。感染の24時間後、インターフェロンガンマは、活性化抗原特異的OT1 CD8 T細胞およびNK細胞を含む複数の細胞によって産生される。サイトカイン分泌を阻害するBFAを用いることなく、NK細胞によるインターフェロンガンマの検出が大きく損なわれた。
B細胞、限界領域マクロファージ、および全マクロファージを、LM OVA感染後のインターフェロンガンマ産生細胞の位置を示すために染色した。興味深いことに、クラスター化された抗原特異的T細胞は脾臓の白いパルプの中に位置していたが、それらはNK細胞がそれらと共存していた領域でのみインターフェロンガンマを産生する。インターフェロンガンマとNK対CD8陽性T細胞の異なる細胞内局在化が示された。
NK細胞におけるインターフェロンガンマ局在化はサイトゾルに拡散したが、CD8陽性T細胞は、しばしば別のT細胞に向けてインターフェロンガンマをリクルートした。ブレフェルディンAの注射は、その場でサイトカインを検出するために重要です。細胞はサイトカインを素早く分泌し、取り込むことが多く、細胞内に蓄積させるためにサイトカイン分泌を阻害する必要があります。
この方法は、サイトカイン産生細胞を自在環境に戻す発見ツールです。この環境の組成を解読することで、インターフェロンガンマに影響を与えたり影響を受けたりする可能性のあるこの場所に存在する適切な細胞または免疫メディエーターに焦点を当てることができます。組織における細胞の正確な局在化は、その機能にとって極めて重要であるという理解が高まっています。
当社のプロトコルは、サイトカイン産生細胞の局在を同定し、それによってその機能をさらに特徴付けることを可能にする。
