この方法は、潰瘍性大腸炎およびクローン病に関する炎症性バイオ疾患分野の重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、シグナルタンパク質の最初の抗およびプロインファマトリー効果を評価するために使用できることです。この技術の意味は、新しい進歩と炎症におけるガスの調査を拡張します。
この方法は、腸の炎症に遺伝的影響に関する洞察を提供することができますが.また、食事やマイクロバイオームなどの他の要因に適用することができます。一般的に、今学期に新しい個人は、病気の瘢痕組織を処理することは難しいので苦労します。
この方法の視覚的なデモンストレーションは解剖として重要であり、菌体および細胞組織構造が変化する可能性があるため、組織調製ステップは学習が困難である。デキストラン硫酸ナトリウム、またはDDS大腸炎を誘導するには、通常の飲料水を3%DSS溶液に置き換え、7日間リビジウムを添加する。各マウスの体重、DSS溶液の消費量、およびスツールの毎日の生産を測定します。
7日間の治療の終わりに、マウスを上の位置に置き、小さいはさみを使って腹部に3センチの長い正中線切開を行います。脾臓を収穫し、そのサイズを測定します。その後、鉗子を使用して結腸を持ち上げ、周囲の腸間腸から分離できるようにします。
そして、盲腸と直腸が見えるまで結腸全体を抽出します。コロノーゼカルマージンで組織をトランセクトする。そして、骨盤内の深い、それぞれ近位および遠位結腸を解放する。
分離されたコロンの長さを測定し、記録します。そして、ガベージ針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、10ミリリットルの氷冷PBSで結腸を洗い流し、消火物が透明になるまでフェースと血液を取り除きます。組織学的同定のために、組織サンプルを同じ大きさの近位、中間、遠位のセクションに分割します。
そして、摂氏4度で一晩4%パラホルムアルデヒドで組織を固定します。分離された結腸組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色の場合、翌朝、サンプルのクライオ保護のために個々の15ミリリットルのチューブに一晩30%スクロースおよびPBSに組織片を水没させる。翌日、最適な切断温度またはOCT化合物に組織を埋め込んだ。
そして、OCTが硬化するまでマイナス20度で組織を冷却します。OCT ブロックをクライオスタットに入れ、厚みダイヤルを 12 マイクロメートルに設定します。その後、ガラス顕微鏡スライドに12マイクロメートルの厚さの凍結切片をスライスして収集します。
すべての組織が切り離されたら、ホットプレートで摂氏65度でスライドを20分間温めます。そして、ヘマトキシリン染色液で5分間染色する前に、加熱されたセクションを蒸留水で短時間洗います。余分なヘマトキシリン溶液を取り除き、水道水で5分間実行します。
そして、エタノール中の0.5%塩酸で30秒間分化し、続いて水道水の下で1分間リンスを行います。次に、PBSでサンプルを1分間洗浄します。続いて水道水の下でさらに5分間の洗浄。
洗浄の終わりに、浸漬ごとに10秒間上昇エタノール系列に組織を沈めます。続いて2分間エオシンで対抗する。サンプルの脱水のために、95%エタノールにスライドを沈め、浸漬ごとに5分間100%エタノールの2つの変更を浸漬します。
その後、キシレンの2、5分の変更でクリア。次に、各実験群の近位、中間、および遠位結腸に対する組織損傷をスコア付けする。免疫ヒストケミカル分析のために、ホットプレート上で20分間セクションを温めた後、PBSで3回、洗浄1回10分間洗浄する。
そして、10分間3%過酸化水素インキュベーションで内因性ペルオキシダーゼを除去します。インキュベーションの終了時に、サンプルをPBSで3回洗浄し、室温で少なくとも1時間ブロッキングバッファーを用いた非特異的結合を遮断します。次いで、ブロッキングバッファーを目的の一次抗体カクテルに交換します。
摂氏4度で一晩インキュベーションを行う場合。翌朝、過剰な一次抗体溶液を吸引し、スライドをPBSで3回洗浄した。最後の洗浄後、適切なビオチン化二次抗体カクテルでスライドをインキュベートします。
続いて、レンサビジンワサビペルオキシダーゼ複合体を室温で標識する。免疫反応性細胞を可視化するには、明るい色または暗褐色が現れるまで、DAB でサンプルにラベルを付けます。そして、ヘマトキシリンと0.3%希釈アンモニアとのセクションに対抗する。
スライドが乾燥したら、光顕微鏡を使用して、10倍の拡大率で組織切片の明るいフィールド画像を得る。そして、画像処理プログラムを使用して、上皮と層状層の両方でマークされた免疫細胞の集団を同定し、定量化する。DSS処理された結腸での遺伝子発現解析では、標準のRNA抽出プロトコルに従ってマイナス80°Cの大腸組織サンプルからRNAを抽出します。
そして、20ミリモルオリゴデオキシチミジン12〜18プライマーの2.5マイクロリットルとモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素の1マイクロリットルと1マイクログラムを混合します。摂氏42度で60分間のインキュベーションを行った後、cDNAの1マイクロリットルを0.5%マイクロリットルの適切なフォワードおよび逆定量PCRプライマーで、目的のサイトカインおよび2x蛍光グリーン染料に混ぜます。次に、適切なパラメータで定量PCRを実行し、標準的なプロトコルに従って相対遺伝子発現を計算します。
野生型マウスと比較して、α突結ノックアウトマウスは、過度の体重減少、下痢および腸出血を伴うより重度の大腸炎を示す。DSS投与の7日後、結腸セクションの組織学的分析は、ノックアウトマウスの近位、中部、および遠位結腸内のより悪化した組織損傷を、野生型のマウスと比較して明らかにする。この過剰な免疫活性化は、免疫物質化学的分析によって観察されるノックアウト動物結腸における様々な炎症性細胞の強い浸潤を伴う大腸炎の誘導をもたらす。
また、定量PCR分析は、より高いレベルのTNFアルファおよびインフェロンガンマ発現を示すが、IL-5、10、および13の低い発現は、TGFβ1発現に差のない野生型マウスの結腸と比較してノックアウトで認められる。この手順を試みる間, テキストサウスバターナトリウムの投与量とデモンストレーション期間を最適化することを覚えておくことが重要です。.この手順を転送すると、培養を得るような他の方法は、腸組織発生における炎症の影響などの追加の質問を理解するために行うことができる。
開発後、この技術は、腸の炎症分野の研究者がバイオ疾患浸食および他の脊椎動物の重症度に対する遺伝子変異の寄与を探求する道を開く。病気の腸組織とその内容物を扱うことは非常に危険であり、適切なものを身に着けているなどの反響は、常にこの手順を実行している間に永久的な個人的な保護を取るべきであることを忘れないでください。
