まず、解剖したマウス組織を5%FBSを含む冷細胞培養培地に入れます。鋭利な解剖ハサミを使用して、約5ミリメートルの断片が得られるまで組織を切り刻みます。みじん切りにした断片をCチューブに移し、1ミリリットルの細胞培養培地を加えます。
Cチューブを電動デバイスにロードし、チューブホルダープレートをD字型のチューブ底に取り付けます。テンションアームをアクリルプレートにラッチして、チューブをモータープレートに固定します。メインメニューから電動デバイスにカスタムプログラムを設定するには、青いボタンを押してカスタムモードを選択します。
最初のカスタムモードメニューで、緑色のボタンを押して、正回転の持続時間を30秒に指定します。次に、青いボタンを押して、画面上の値を選択します。2番目のカスタムモードメニューで、緑色のボタンを押して、逆回転の持続時間を10秒に指定します。
次に、青いボタンを押して、画面上の値を選択します。3番目のカスタムモードメニューで、赤いボタンを押して、選択ループを4回に指定します。次に、青いボタンを押して、画面上の値を選択します。
電圧調整tage制御ダイヤルを200RPMに調整し、カスタムプログラムを開始します。次に、解剖した組織を含む4ミリリットルの低温培地に消化酵素を加えます。もう一度、Cチューブをデバイスにロードし、前に示したようにカスタムプログラムを繰り返します。
分析後、装填したチューブを入れたデバイスを摂氏37度のインキュベーターに45分間移します。次に、Cチューブをデバイスにロードし、カスタムプログラムを50RPMに設定し、正回転を270秒に設定します。逆回転を 30 秒に戻し、9 回ループします。
EDTAを5ミリモルの最終濃度でサンプルに添加します。カスタムプログラムを100RPMに設定し、正回転を30秒に設定します。逆回転を 10 秒に戻し、2 回ループします。
次に、細胞懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーに通し、50ミリリットルまたは15ミリリットルのチューブに濾液を回収します。採取した細胞懸濁液を300g、摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁し、1分間インキュベートします。
溶解バッファーを9ミリリットルの低温PBSで中和します。再度、細胞を遠心分離し、ペレットを目的のバッファーまたは培地に再懸濁します。電動装置と手動解離で調製した細胞懸濁液は、マウスの肺、腎臓、および心臓組織全体で同等の細胞生存率と収量を示しました。
T細胞や樹状細胞などの免疫細胞集団は、単離プロトコルによって有意な影響を受けませんでした。また、表面マーカーの発現は、樹状細胞における抗原提示マーカーMHC IIの平均蛍光強度において、手動単離とデバイス単離で同様の頻度を示しました。
