CHO-P細胞は博士バーバラ·フューリー（ベスイスラエルメディカルセンター、ハーバード大学医学部）からの親切な贈り物だった。この作品は、この作品にもJMKにMovember - 前立腺がん財団チャレンジ賞によって部分的にサポートされていましたJMKに健康グラントHL095722の国立研究所によってサポートされていました

1。細胞培養<ol><li>ヒト前骨髄球性白血病（HL-60）細胞<ol><li> 75センチメートル培養HL-60細胞を20％（v / v）ウシ胎児血清（FBS）、1％（v / v）のL-グルタミンおよび1を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、15 mlの2フラスコ％（v / v）のペニシリン - ストレプトマイシン。 </li><li>細胞懸濁液体積の半分を吸引し、完全IMDM培地に置き換えて3日毎に培地を変更します。 </li><li>カルボキシフルオレセインジアセテートは、スクシンイミジルエステル（CFSE）染色、遠心HL-60細胞懸濁液（400×gで、5分間）、（予め温めたPBSで調製）1μMCFSE溶液中で再懸濁し、37℃で15分間インキュベートするその後、30分間、新鮮な温めておいた培地中の遠心分離機細胞、吸引上清と細胞を再懸濁。 PBS中で細胞を洗浄した後、（P-SELでコーティングされた表面にCFSE染色したHL-60細胞の代表的な画像については、図1（b）参照 ）、圧延実験に使用しています。 </li></ol></li></ol><ol start="2"><li>肺微小血管内皮細胞（LMVECs） <ol><li>コー​​ト100ミリメートルのペトリ皿を0.1％ゼラチン溶液（PBS中のv / v）を有する少なくとも30分間37℃でインキュベートする。 </li><li>特定の成長サプリメントキットを補充した完全内皮増殖培地中のゼラチンコート100ミリメートルペトリ皿（内皮基本培地-2（EBM-2））が、試薬を参照してください上の文化LMVECs）。メディアの80〜90％のコンフルエンスに達したとき、一日おきにサブ培養細胞を変更します。 </li><li>継代培養のために、PBSで細胞を洗浄した後、細胞を1×デタッチトリプシン-EDTA 4mlで3分間、37℃で、完全EBM-2培地の等量を中和。 15mlチューブとcentrifugに細胞懸濁液を転送する電子メール（400×gで、5分間）。遠心分離後、完全な内皮培地1ml中にペレットを再懸濁し、血球計算板を用いて細胞を数える。これはすべての実験のための通路7でのみ細胞、それらの形態や機能、使用に影響を与えるように、オーバー継代細胞をしないでください。 </li></ol></li></ol><ol start="3"><li>チャイニーズハムスター卵巣-P-セレクチン（P-CHO）細胞<ol><li>安定的にヒトP-SELを発現するようにトランスフェクトしたCHO細胞であるCHO-P細胞は、共同研究者（ベスイスラエルメディカルセンター、ハーバード大学医学部）11,12によって提供された。 </li><li> T175のCMにおける培養したCHO-P細胞のF-12培地25ml中2のフラスコ。 </li><li>継代のために、4〜5秒間10mlのPBSで細胞を洗浄した後、完全なメディアで中和し、37℃で3分間1Xトリプシン-EDTA 10mlにトリプシン処理。 </li><li>細胞懸濁液を遠心分離（400×gで、5分間）、注意深く上清を吸引完全培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁して細胞を数える血球計数器。 </li></ol></li></ol> 2。統合されたマルチウェルプレートのマイクロ流体システムの動作<ol><li>すべての機器が正しく接続されていることを確認し、異なるモジュールをオンにする：コンピュータ、コントローラ、倒立顕微鏡、CCDカメラ。 </li><li>イメージングソフトウェアを開き、マルチウェルプレートモジュール及び撮像モジュールが正しく画面に表示されていることを確認してください。 </li><li> （コントローラに接続されている）、蒸気トラップにチューブを接続し、また、圧力のインターフェイスに接続します。 </li><li>プレートヒーター/アダプタでマルチウェルプレートを置きます。ウェルに試薬を追加します（後述）、プレートの上にインターフェイスを接続します。自動化されたステージ上で画像化のためにプレートを置きます。 </li><li>インタフェースは、プレートの上面に取り付けられ、定義された流速でマイクロ流体チャネルを通して流体を駆動する、ウェルの上部に、コントローラからの空気圧を印加し、容易にマルチウェルプレートを使用して制御マニュアルモードでモジュール画面。 </li><li>井戸の間に位置し、観察領域、全体のチャネルフローの試薬。マイクロ流体チャネル寸法は70μmで高さ350μm幅Xです。線形チャネルの長さは1mmであり、チャネルの底部は、明視野、位相、蛍光および共焦点顕微鏡と互換性のある180μmのカバースリップガラスを含む。 </li><li> CCDカメラ（ストリーム取得、11フレーム/秒）を使用してビデオを取得し、互換性のあるソフトウェアを使用して分析します。 </li></ol> 3。タンパク質基質や細胞単層を持つマイクロ流体チャネルのコーティング<ol><li>フィブロネクチンまたはP-/E-selectinとマイクロ流体チャネルをコーティング<ol><li> PBS中20μg/ mlのフィブロネクチン溶液1mlを準備します。コー​​ティングされるチャンネル数（チャネルあたりフィブロネクチンの25〜50μlを使用する）に基づいてボリュームを変更します。 </li><li>各ウェル入口にフィブロネクチン溶液を25〜50μlを加える。 2 DYN / cm 2のせん断力を加え、5分のチャネルを灌流するため。液体がよく口に登場するのビードに注意してください。室温で30〜45分間インキュベート</li><li> 1,13（チャネルを供給する中央のサークルから直接吸引していない）をウェルから溶液を吸引除去する。コンセントウェルにPBSを200〜500μLを加え、5分間2ダイン/ cm 2のせん断流を適用することにより、PBSでチャンネルを洗う。チャネルが正しくフィブロネクチンおよび使用可能な状態で被覆される。 </li><li>表面コーティングを可能にするために、37℃で1時間インキュベーションして、上記のようにP-またはE-selの、PBS中で所望のヒト組換えタンパク質を5μg/ mlの溶液を調製し、コートチャンネルをコートする。 </li></ol></li><li>マイクロ流体チャネルの内部CHO-PまたはLMVEC単層の作成<ol><li>穏やかに完全培地および遠心分離機の2倍容量（400×gで5分間）を用いてクエンチし、3分間培養皿から細胞をトリプシン処理。フルメディアや遠心分離機の10ミリリットル（400×gで5分）で細胞を再懸濁agaiN。 </li><li>懸濁液中の細胞濃度を決定するために、細胞を計数。チャネル内部のLMVECコンフルエントな単層の形成を確実にするために15〜20万細胞/ mlに細胞濃度をもたらす。コンフルエントCHO-P細胞単層の場合は、50から60000000個/ mlを使用しています。各チャンネルごとに細胞懸濁液の25〜50μlを使用する - それに応じて実験に用いた最初の細胞数を決定する。 </li><li>よく入口に適当な濃度での細胞懸濁液の25〜50を添加する。顕微鏡ステージ上でプレートを置き、細胞が全体のチャンネルを埋め、画面上で観察されるまで、チャネル（2 DYN / cm 2）の中に細胞を導入してから、流れを止める。 </li><li>フルLMVECまたはCHO培地のどちらか200μlの出口及び入口の両方を記入してください。細胞が沈降しましょうし、インキュベーター（37℃、5％CO 2）で3時間付着する。 </li><li> 3時間のインキュベーション後、付着していない削除する完全なメディア（2 DYN / cm 2で、10〜15分）でチャンネルを洗う細胞。細胞は完全にコンフルエント表示され、チャネルが使用できるようになりました。初期細胞播種密度に依存して、整定時間の追加の2〜3時間、細胞と表面の完全な被覆を確実にするために必要とされてもよい。 </li></ol></li></ol> 4。 LMVECは、炎症誘発性活性化とP-/E-selectinの抗体ブロッキング<ol><li> LMVEC基礎培地中のTNF-α溶液（10 ng / mlの）を準備します。 </li><li>チャンネル内LMVECの炎症活性化を誘導よく入口に、TNF-α溶液100μlを加え、5分間2 DYN / cm 2のせん断流を適用することにより、チャネル内にソリューションを導入することができる。制御チャネル（非活性ECS）の場合は、よく入口にLMVEC基礎培地を100μlを加え、チャンネル（5分間2 DYN / cm 2）の中に導入する。チャネルは現在、ローリングアッセイの準備ができている。 </li><li> P-SELとLMVECs及びCHO-P細胞に対するE-SELをブロックするには、P-SEL（クローンAK4、BAにおける5μg/ mlの中和紹介SALメディア）またはE-SEL（クローンP2H3、基礎培地中の5μg/ ml）をチャネルに抗体および37℃で1時間インキュベート次に、（5分間2ダイン/ cm 2）を基本培地でチャンネルを洗う。チャンネルは現在、ローリングアッセイの準備ができている。 </li></ol> 5。基板/細胞単層被覆マイクロ流体チャネル上で、HL-60ローリングアッセイ<ol><li>注意深く（細胞によるコーティングの場合には、完全にコンフルエントな細胞単層が観察されるべきである）チャネルが適切に被覆されていることを確認するために顕微鏡下でのチャネルを調べる。 </li><li>ローリング実験は、遠心機HL-60細胞懸濁液（400×gで5分）HL-60細胞懸濁液を調製し、基本培地で一回洗浄する。 IMDM中の細胞を再懸濁をカウント（基本培地のCa 2 +およびMg 2 +を含有する）3万細胞/ mlのHL-60細胞懸濁液を作成する。ローリングアッセイを行うために、チャネルごとに細胞懸濁液を25〜50μlを使用する。 </li><li>セルsuspeの25〜50μlを添加nsionは、顕微鏡ステージ上に温度制御されたプレートホルダ（37°C）と場所の内部で、ウェル場所プレート出口する。次に、（細胞が入口にコンセントから流れる10月15日秒以内に観察されるべきである）2 DYN / cm 2のせん断力を加えることにより、チャネルに細胞を導入する。 </li><li>せん断応力の関数としてローリング応答を調べるために、（5 DYNまで0.25から徐々に剪断力を高めるDYN / cm 2で0.25に剪断力を減少させ、各々の所望の剪断（「ストリーム取得」機能を使用して）、20〜30秒のビデオを取得する/ cm 2であることがより高い剪断を使用することも可能である）。 </li><li> CCDカメラ（ストリーム取得、11フレーム/秒）を使用してビデオを取得し、互換性のあるソフトウェアを使用してパスをロール圧延速度を分析する。 </li></ol> 6。表面分子の発現を検出するために、フローサイトメトリー<ol><li>トリプシン処理後、所望の細胞型（HL-60、CHO-（1-2×10 5細胞/サンプルを使用して）細胞懸濁液を調製PBS中のP又はLMVECs）（ - / - ）、2％のFBSを補充した。細胞を2回洗浄し、50μL（同じバッファを使用）にサンプル量を持って来る。 </li><li> 20分間、4℃で所望の蛍光団結合抗体（詳細については、添付の表を参照）（アルミホイルでカバー）で各サンプルをインキュベートする。 </li><li>細胞を2回洗浄する（同一緩衝液）200μlに染色された細胞懸濁液の最終体積をもたらす。表面分子の発現を検出するためにフローサイトメーターを用いてサンプルを分析する。 </li></ol>

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Ther. 16, 571-579 (2008).</li><li>Enoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+mesenchymal+cell+engraftment+by+IGF-1+improves+left+ventricular+function+in+rats+undergoing+myocardial+infarction.">Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction.</a> Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).</li></ol>

著者らは、利害の競合を宣言していません。

外因性の細胞ベースの治療の成功翻訳の主要な課題の一つは、効率的に、高い生着効率3で ​​傷害や炎症部位 ​​に細胞を送達することができないことである。細胞ローリングは、最終的に組織5への内皮を通して、強固な接着および遊出を導く血管壁上のセルの減速を促進する、細胞のホーミングの過程における重要なステップを表している。候補セルタイプの圧延プロ?...

細胞ベースの治療の成功臨床翻訳の主要な課題の一つは、非効率的な配信や希望のサイト3,4に全身注入された細胞の標的である。従って、細胞ホーミングを改善するためのアプローチのための一定の探索があり、具体的には細胞療法を改善するための戦略として、ローリング細胞。血管に細胞ローリングは、古典的に疾患部位5に補充される白血球のために定義され、細胞のホーミングカスケードにおける重要なステップである。このステップは、すなわち 、内皮セレクチン間の特異的相互作用によって支配されるP-およびE-セレクチン（P-およびE-SEL）、及びそれらのカウンターリガンド白血球5,6の表面に。理解と細胞のホーミング、具体的には、圧延工程の効率改善は、細胞ベースの治療を改善するための新しいプラットフォームのための探求で非常に重要である。今日まで、この2つの平らなプラットフォームを含む、パラレルプレートフローチャンバー（PPFCs）を使用することによって達成されている細胞懸濁液をシリンジポンプ7,8、9を用いて灌流されたプレートを介して上部に位置する流入および流出ポートと、それらの間にガスケットを有するエス。底板の表面は、関連する細胞単層/基材で被覆することができ、せん断流下灌流細胞と表面との間の相互作用は、その後7を検討している。しかし、PPFCは気泡形成、漏洩、および主要な欠点​​を提示するコントロール不良の流れと、低スループット、試薬がかかり、かなり面倒な方法です。 従来のPPFCの代替技術は、低消費1,10試薬と細胞アッセイ（PPFCsより最大10倍高い）正確な、コンピュータ制御されたせん断流の下で、より高いスループット性能を可能にする、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムである。細胞ローリング実験は、マイクロ流体チャネル内で実行されている細胞単層または操作された基材で被覆することが可能とUSIをイメージngのローリング特性を有する顕微鏡は、容易に適切なソフトウェアを用いて分析した。本研究では、異なる表面上のヒト前骨髄球性白血病（HL-60）細胞のローリングの特性を研究することによって、このマルチウェルプレート、マイクロ流体システムの能力を実証する。 HL-60 P-およびE-selの様基板上の、ならびに異なるローリング受容体を発現する細胞単層上を転動を分析した。また、ブロッキング抗体（Ab）は、それらの表面上のHL-60の回転運動を媒介する特定のセレクチンの直接的な関与を実証した。ローリング実験は、圧延速度、ローリング細胞の数、および圧延パス特性などの主要圧延パラメータの効率的な解析を可能にする、最小限の試薬/細胞消費で、安定したせん断流の下で、増大したスループットを用いて行った。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Lung Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)</td>
			<td>Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-60 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV SingleQuots</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM - Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (L/G) 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Sa550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)</td>
			<td>MedSupply Partners</td>
			<td>TC1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin Solution (2%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hE-Selectin/CD62E</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated Mouse IgG1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hP-Selectin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated Mouse IgG1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG&#173;1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC70545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC70545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC2859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>556055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1 k Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-P-Selectin Ab (AK4)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC19996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Isotype Control</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC3877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human P-selectin-FC recombinant protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>137-PS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human E-selectin-FC recombinant protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>724-ES-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Human, Plasma</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflux 1000</td>
			<td>Fluxion Biosciences</td>
			<td>Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlux 48-well plates</td>
			<td>Fluxion Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSnap HQ2 CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systematic analysis of in vitro cell rolling using a multi-well plate microfluidic system

細胞ベースの治療のための主要な課題は、全身静脈内または動脈内注入後、目的の組織への高い効率での生存細胞を大量に標的とすることができないことである。従って、細胞ホーミングを増大は、現在細胞治療を改善するための戦略として検討されている。血管内皮上の細胞ローリングは、細胞ホーミングの過程における重要なステップであり、平行平板流動チャンバ（PPFC）を用いてインビトロで調べることができる。しかしながら、これは、コントロール不良のフロー条件で、非常に退屈な、低スループットアッセイである。代わりに、我々は正確に制御され、生理学的に関連するせん断流1,2の下で、より高いスループットで携帯圧延性質の研究が可能になり、マルチウェルプレートのマイクロ流体システムを使用していました。本論文では、HL-60の転がり特性（人間の前骨髄球性白血病）、P-およびE-セレクチンでコーティングされた表面上での細胞だけでなく、細胞の単層でコーティングされた表面にはreadilする方法を示しYは、検討した。良好な炎症状態をシミュレートするために、マイクロ流体チャネルの表面は、次いで、有意に動的条件下でのHL-60細胞との相互作用を増大させる、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）で活性化した内皮細胞（EC）でコーティングした。強化されたスループットと、このような速度を圧延パス圧延などのパラメータの迅速な分析を可能にする統合されたマルチパラメータ解析ソフトウェアプラットフォームは、 インビトロの細胞ローリングの特性を評価するための重要な利点である。細胞ローリングおよびホーミングに影響を与えるように設計された工学的アプローチの迅速かつ正確な分析を可能にし、このプラットフォームは、あらかじめ、外因性細胞ベースの治療を助けるかもしれない。

HL-60細胞は、フィブロネクチン上でP-およびE-セレクチンの表面上にロールではなく、 彼らはローリングリガンド、P-SEL糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）およびシアリル-ルイスX（のSLeX）を含むホーミングリガンドの様々 5,14（ 図1（a）を表現するように、HL-60細胞は、ゴールドスタンダード&quot;ローラー&quot;と考えられている）。との特異的な相互作用?...

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Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

この研究は、有意に生理学的に関連するせん断流の下で細胞ローリング研究のスループットを向上させる、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムを用いる。カスケードおよび患者における細胞の外因集団の全身送達後の細胞のホーミングの重要性をホーミング多段階の細胞における細胞ローリングの重要性を考えると、このシステムは、細胞ベースの治療を改善するためのスクリーニングプラットフォームとしての可能性を提供しています。

の体系的な分析<em&gt;体外</emマルチウェルプレートマイクロ流体システムを使用して&gt;セルローリング

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

systematic-analysis-vitro-cell-rolling-using-multi-well-plate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

11.9K ビュー.  Brigham and Women's Hospital. この研究は、有意に生理学的に関連するせん断流の下で細胞ローリング研究のスループットを向上させる、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムを用いる。カスケードおよび患者における細胞の外因集団の全身送達後の細胞のホーミングの重要性をホーミング多段階の細胞における細胞ローリングの重要性を考えると、このシステムは、細胞ベ?...

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス<em&gt;体外で</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

生物工学

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

非対称受容体のパターンでセルローリング軌道を勉強

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

ハイスループットの使用<em&gt;インビトロ</emオーラル多種バイオフィルムを開発するために&gt;マイクロ流体システム

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. Unfortunately, many researchers spend large amounts of time and resources developing and optimizing workflows that are only relevant to their own experiments. In this article, we describe a protocol that can be used by those with access to a widefield high-content analysis system (WHCAS) to image any slide-mounted tissue, with options for customization within pre-built modules found in the associated software. Not originally intended for slide scanning, the steps detailed in this article make it possible to acquire slide scanning images in the WHCAS which can be imported into the associated software. In this example, the automated segmentation of brain tumor slides is demonstrated, but the automated segmentation of any fluorescently-labeled nuclear or cytoplasmic marker is possible. Furthermore, there are a variety of other quantitative software modules including assays for protein localization/translocation, cellular proliferation/viability/apoptosis, and angiogenesis that can be run. This technique will save researchers time and effort and create an automated protocol for slide analysis.

Here we describe a protocol for the automated segmentation of fluorescently labeled tissues on slides using a widefield high-content analysis system (WHCAS). This protocol has wide-ranging applications in any field which involves the quantitation of fluorescent markers in biological tissues including the biological sciences, medical engineering, and health sciences.

自動スライド スキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...