The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.

以下に説明するために、ここに実験プロトコルを実行します。マイクロ流体プラットフォームを作成するための微細加工プロトコルは、ステップ1、ステップ2で説明されています（ 図2）細菌培養プロトコルを説明し、実験装置（ 図3）の組み立てステップ3が関係。最後に、実際の実験手順は、工程4に記載されている。 1チップ製造手順注：適切な安全手順は、以下に記載のプロセスに従わなければなりません。詳細については、制度的安全管理者に相談してください。 <ol><li>適切なソフトウェア（ 例えば 、L-Editの）マスクを設計します。チャンネルのデザインは、幅625ミクロンの主なマイクロ流路で構成されています。チャネルの中央領域の直径が50μmの微細柱の配列が含まれ、（補足ファイルを参照してください）​​離れて25μmの間隔をあけ。 </li><li>ガラス上このデザインを印刷（5 &quot;×5&quot;ソーダライムガラス次に、クロムエッチング液を用いCr層をエッチングし）、その0.09の厚さを有し、「フォトマスクを製造するためにマスキングを使用して、クロム（Cr）の約70nmの厚さの層で被覆されている。1分間使用してAZ400K現像液。約1分間のレジストと冷たいピラニア溶液でそれをきれいに取り除くために、アセトンを使用してください。（H 2 SO 4とH 2比3 O 2：1）。 </li><li>フォトリソグラフィー<ol><li> 20分間ピラニア溶液と化学的に標準的な4 &quot;のシリコンウェハを清掃してください。 </li><li> DI水でウェーハを洗浄して、それを乾燥させます。 </li><li>ホットプレート（15分間200℃）上のウエハ加熱する。 </li><li>コー​​トレジストを有するシリコンウェーハ。ここでは、ポジ​​型フォトレジストAZ4620は12.5ミクロンの厚さの層を得るために25秒間2000rpmでシリコンウェハ上にスピンコートした。 </li><li> 100℃で窒素流で90秒間ウェハを浮遊させることによって、ホットプレート上でウェーハのソフトベークして、すべての溶媒を除去します。次に、tに真空中でそれを維持60秒間、彼は同じ温度。 </li><li>脱水のための24時間暗箱にウェハを配置します。 </li><li>フォトレジストに設計されたパターンを転写するために、UV光にウェハを公開します。 </li><li> 240秒間、フォトレジスト現像液（AZ400K）のウェハを浸し。その後、イソプロピルアルコール、ウエハをリンスし、窒素ガス流中に置くことによって、それを乾燥させる。 </li></ol></li><li> ICP-DRIE（誘導結合プラズマ - ディープ反応性イオンエッチング）プロセス<ol><li> DRIEエッチングを適用します。デバイスに必要な最終的な深さ（この調査では50程度）に応じて適切なエッチング深さを選択してください。フォトレジストは、このプロセスの間にマスキング層として機能します。 </li><li>アセトンで残りのフォトレジストを除去し、ウェーハを洗浄してください。 </li></ol></li><li> PDMS（ポリジメチルシロキサン）鋳造<ol><li>シリコンマスターモールドをシラン化するためのトリクロロメチルシラン（TCMS）を使用します。バイアル中のトリクロロメチルシランの2または3滴を注ぎ、横にデシケーターに入れてくださいシリコンマスターモールド。シラン化プロセスが完了するまで2〜3時間を許可します。 </li><li> PDMSを製造するために1：別の容器に、10の重量比で硬化剤とのSylgard 184シリコーンベースを混合する。真空条件（約2時間）に供することによりPDMSを脱気。 </li><li>ホルダにシリコンマスターモールドを入れてください。その後、PDMSスタンプを形成するために、シリコンマスターモールド上にPDMSを注ぐ。気泡がこのプロセスの間に、PDMSで形成されないことを確認してください。 </li><li> 80℃で2時間、PDMSを治す。 </li><li>マスターモールドからPDMSスタンプをはがし。その後、独立したマイクロチップにPDMSスタンプを切った。最後に、入​​口および出口（単数または複数）のための穴をドリル切削コアを使用する。 </li></ol></li><li>ガラスへのPDMSの接着<ol><li> 30秒間酸素プラズマにカバースリップとPDMSスタンプを公開します。カバースリップに結合PDMSスタンプ。 </li><li> PDMSスタンプとカバースリップとの間に適切なシールを達成するために、70℃で10分間オーブンに入れるなどして、デバイスをアニールする。 </李&gt; </ol></li></ol> 2細菌培養注：適切なバイオセーフティ·プロトコルは、ステップ2〜4のために従わなければなりません。詳細については、制度的安全管理者に相談してください。 <ol><li> LB寒天プレートを準備します<ol><li> 20グラムルリア - ベルターニ（LB）寒天（ミラー）粉末、超純水500mlを1Lのフラスコに入れる。粉末を溶解するために撹拌する。 </li><li> 15 psiの、15分間121℃でオートクレーブすることにより滅菌する。 </li><li>フラスコをベンチやバイオセーフティーフード内で水浴中で50〜55℃まで冷却して。 </li><li> 50μg/ mlの最終濃度を達成するために抗生物質テトラサイクリンを加える。旋回でよく混ぜる。 </li><li>プレートに混合物を注ぐ。フル2分の1〜3分の2まで各プレートを埋める。 </li><li>炎空気はそれらが形成する場合は、それらをポップするために簡単に泡。固化した気泡は、細菌培養にわたって拡散することが困難である。 </li><li>プレートを室温で一晩冷却してください。 </li><li>彼らはクールである場合、戻って自分の袖にプレートを入れて、袋を密封し、ラベル（抗生物質および日付）、そして4℃で保存してください。 注：光は多くの抗生物質を不活性化するように、スズ箔でプレートの株式をカバー。 </li></ol></li><li> LBブロス準備<ol><li> 20グラムルリア - ベルターニ（LB）ブロス（ミラー）粉末および超純水1Lをフラスコに加える。粉末を溶解するために撹拌する。 </li><li> 15 psiの、15分間121℃でオートクレーブすることにより滅菌する。 </li><li>フラスコをベンチやバイオセーフティーフード内で水浴中で50〜55℃まで冷却して。 </li><li> 50μg/ mlの最終濃度を達成するために抗生物質テトラサイクリンを加える。旋回でよく混ぜる。 </li><li>ときにクール、4℃で標識ボトルを置く。 注：光は多くの抗生物質を不活性化するように、スズ箔でボトルをカバー。 </li></ol></li><li> LB寒天プレートに培養菌（このプロトコルが使用するシュードモナス·フルオレッ ） <ol><li>冷凍庫から細菌の株式を取る（-80°; C）と氷の上に置きます。 </li><li>バイオセーフティーフードの内側に-80℃で細菌株式およびLB寒天プレートを置きます。 </li><li>ストリークジグザグパターンでLB寒天プレート上に細菌株。寒天プレートをカバーし、一晩30℃以上でそれをインキュベートする。最後に、4℃の冷蔵庫内のプレートを格納します。 </li></ol></li><li>菌液を準備する（S1） <ol><li>オートクレーブをフラスコに50ミリリットルのLBブロス培地を注ぐ。バイオセーフティーフードの内側に、この操作を実行します。 </li><li>フラスコにLB寒天プレートから単一の細菌コロニーを転送します。この操作は、バイオセーフティーフード内で行われるべきである。 </li><li> 30℃、適切な時間（4時間）、150 rpmで振とう培養器でフラスコを入れてください。 </li></ol></li><li>希釈菌液（S2）を準備します<ol><li>滅菌プラスチックチューブに5ミリリットルのLBブロス培地を注ぐ。 </li><li> LBブロス培地と混合することにより、S1に希釈する。次いで、この溶液をボルテックス。溶液を希釈希望視神経を達成ら密度（ODは、600nm = 0.1で測定）。 注：バイオフィルムの実験は、通常、この近くでOD値を採用している。 </li></ol></li></ol> 3実験のセットアップを準備します<ol><li>使用方法ピンセットは、マイクロチップの入口および出口の（複数の）への柔軟なプラスチックチューブ（0.20 &quot;ID）を接続してください。入口と出口は、以前にマイクロチップ（ステップ1.5.5）のPDMS部分に掘削された。本研究でマイクロチップは、2つの入口と一つの出口から構成されています。 </li><li>菌液（S2溶液）で注射器（複数可）を記入し、注射器（複数可）内のすべての気泡を除去。 </li><li>入口管（群）へのシリンジチップ（S）（30 G 0.5」鈍針）を接続した後、コンテナを無駄に排出管を接続します。 </li></ol> 4。実験を実行します<ol><li>シリンジチップ（複数可）に注射器を接続します。 </li><li>シリンジポンプにシリンジ（複数可）場所と固定してください。その後DESIRの対物レンズで、光学顕微鏡下でマイクロチップを配置ED倍率（ 例えば 、40X）。 （P. 30℃でオレッ ）細菌増殖のための一定の温度環境を維持するために、ライブセルチャンバー装置を備えたマイクロチップをカバー。 </li><li>所望の流量レベルにポンプを設定します（たとえば10μL/時間）と流体ポンプを開始します。 </li><li>細菌がチャンバ内に導入されると、バイオフィルム形成も開始される。バイオフィルム形成及び成熟は、一般的に数時間または数日の期間にわたって発生する。観察し、顕微鏡でバイオフィルムの成長を撮影。 </li></ol>

<ol>
	<li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+web+of+streamers:+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device.">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms:+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections.">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Wong, G. C. L., O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+together+now:+Integrating+biofilm+research+across+disciplines.">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li><li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow.">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).</li><li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers.">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li><li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems.">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li><li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems.">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li><li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows.">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li><li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems.">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li><li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2.">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li><li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media.">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation.">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li><li>Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).</li><li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil.">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li><li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets.">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li><li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms.">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li><li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media:+energy+applications.">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

私たちは、複雑な生息地でバイオフィルムの発達を研究するための多孔質媒体を模倣シンプルなマイクロ流体デバイスを実証した。実験の結果を決定するいくつかの重要なステップがあります。彼らは、デバイスのジオメトリが含まれています。ポスト形状が変化することができますが、フォームにストリーマに十分な細孔空間が必要である。また、Valiei ら 1はストリーマの?...

最近では、多孔質媒体1を模したマイクロ流体デバイス内の細菌のバイオフィルム形成のダイナミクスを示した。細菌性バイオフィルムは、本質的に、細胞外高分子物質（EPS）2-4によって包まれている表面に凝集する細菌のコロニーである。細菌のこれらの薄膜は、滑らかな表面から多孔質媒体のはるかに複雑な生息地に至るまで、ほぼすべての考えられるニッチを内形成することができる。 Valiei ら 1は多孔質媒体の構造をシミュレートするために、マイクロピラーのアレイを有するマイクロ流体デバイスを使用し、流体の流量の関数として、この装置ではバイオフィルム形成を研究した。彼らはある特定の流れ状態で、ストリーマとして知られている糸状バイオフィルムを別の柱の間に現れ始めたことがわかった。ストリーマは、一方に係留され得るか、または両方が、固体表面に終了するが、その他の構成は、液体中に懸濁されている。ストリーマの形成は、典型的には、バイオフィルムの初期層を形成した後に開始し、そのフォーマットイオンは、このような複雑な生息地でバイオフィルムの長期的な発展を決定することができます。最近、いくつかの研究者は、ストリーマ形成のダイナミクスを調べた。ヤズディら 5はストリーマが発振バブルから生じる渦流れに形成することができることを示した。別の実験では、Rusconiからら 6は、ストリーマの形成にチャネル曲率およびチャネルの形状の影響を調べた。彼らは、ストリーマは、マイクロチャネルの湾曲部分に形成できることを見出し、ストリーマ形態は、運動性に関連する。最近の研究では、ストリーマは、彼らが多孔インタフェースで成熟した構造の形成の前駆体として働くことができるように、さまざまな天然および人工のシナリオで幅広い影響を持つ生物医学システムで迅速かつ壊滅的なバイオフィルムの増殖につながり、また、実質的なフロースルーを引き起こす可能性があることを実証した構造の相互作用など 1,7-9。 バイオフィルム吹流しは、多くの場合、私を形成するそのような多孔質媒体としてのn複雑な生息地。多孔質のメディア環境におけるバイオフィルムの成長を理解することは、例えばCO 2回収11、土壌12中の細孔の閉塞のような状況ではよく穴の整合性を維持、このような生物学的廃水処理10などのいくつかの環境および産業プロセスに関連しています。このような複雑な生息地でのバイオフィルム形成を観察することにより、しばしば多孔質媒体の不透明度に挑戦することができます。それらはリアルタイムで可能にし、 その場での監視にこのような状況では、マイクロ流体ベースの多孔質媒体プラットフォームは、非常に有利で ​​証明することができる。マイクロフルイディクスのもう一つの利点は、単一のバイオマイクロ流体プラットフォーム上で複数のバイオリアクターを構築し、同時にオンライン監視および/またはセンサの組み込みを可能にする機能です。一つの装置で正確な統計分析のために有意な関連データを収集する機能で複数の研究室での実験を実施するための柔軟性が重要である前売りマイクロ流体システム13,14のアンテージ。 上記の議論の文脈では、多孔質媒体環境でストリーマ形成の動態を理解することは、複数のアプリケーションに有益であろう。本研究では、多孔質媒体を模倣装置におけるストリーマの形成を調査するためのプロトコルを開発しています。マイクロフルイディックプラットホームの製造は、細胞培養実験のために必要な手順が記載されている。実験では、 シュードモナス·フルオレッセンスの野生型細菌株を用いた。P.土壌中に天然に見出さフルオレッセンスは、土壌の生態15を維持する上で重要な役割を果たしている。用いられる細菌株は、遺伝的に恒常的に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されていた。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1038">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:339px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Flourescent Microscope</td>
			<td style="width:255px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">LB agar</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1425-500</td>
			<td>suspend 40 g in 1 L of purified water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">LB broth</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-500</td>
			<td>suspend 20 g in 1 L of purified water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Biosafety hood</td>
			<td style="width:255px;">Microzone corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Petri-dish</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">875712</td>
			<td>sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:325px;">Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">Excella E24incubator shaker series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL sterilized centrifuge tube</td>
			<td style="width:255px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td>Polypropylene Rnase-/Dnase-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tetracycline free base</td>
			<td style="width:255px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">103012</td>
			<td>50 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">SYLGARD 184 silicone</td>
			<td style="width:255px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">68037-59-2</td>
			<td>Elastomer Base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Positive photoresist (AZ4620)</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Plastic tube</td>
			<td style="width:255px;">Cole- Parmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for biofilm streamer formation in a microfluidic device with micro-pillars

いくつかの細菌種は、表面に付着したバイオフィルムと呼ばれる薄膜の形態でそれらにコロニーを形成する能力を有する。多孔質媒体で成長バイオフィルムは、このような廃水処理およびCO 2の隔離など、いくつかの産業や環境のプロセスに関連している。私たちは、多孔質媒体を模倣マイクロ流体デバイス内のバイオフィルム形成を調査するために、 シュードモナス·フルオレッグラム陰性好気性細菌を使用していました。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィを用いて作製されたマイクロポストのアレイからなる。続いて、流れにこれらのデバイスにおけるバイオフィルムの形成を検討したと私たちは私たちのデバイス内のストリーマとして知られている糸状バイオフィルムの形成を実証する。マイクロ流体デバイスの製造および組立のための詳細なプロトコルは、細菌培養プロトコールと一緒にここに提供されています。マイクロ流体デバイスを用いた実験のための詳細な手順も、代表と一緒に提示されている結果。

上述した微細加工プロトコルを使用して、PDMSベースのマイクロ流体デバイスを構築した。1は走査電子顕微鏡（SEM）PDMSの画像を示し 、デバイス。 図1aは、装置の入口断面を示している。フォーク状の入り口は、デバイス全体に圧力ヘッドを等しくするために作成されます。さらなるSEMイメージングはまた、柱壁が（ 図1b）は、ほぼ垂直であ?...

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Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.1K ビュー.  University of Alberta. Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated. 

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス<em&gt;体外で</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

生物工学

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

あらかじめ設計されたサイズと形状を用いるポリマー繊維およびバイオハイブリッド繊維のマイクロ流体製造

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

マイクロスケールシュリーレン法によるマイクロ流体デバイス内の混合不均一性の分析

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

コンビナトリアルプラグ製造のためのマイクロ流体デバイスの構築

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

著者スポットライト:Precision Oncologyにおける計算アプローチと実験的アプローチの統合

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

コンビナトリアルプラグ製造のための二層マイクロ流体デバイス

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...