phiC31インテグラーゼ媒介胚トランスジェネシスのための ショウジョ ウバエ胚のマイクロインジェクション

まず、絵筆で、脱塩素化されたショウジョウバエの胚をブドウ寒天の長いストリップに移します。解剖針を使用して、ストリップの端に沿って約60個の胚を裏打ちし、後部を外側に向けています。次に、長さ18mmの両面テープをカバースリップの端に沿って縦に貼り付けます。

裏地を取り外した後、カバースリップを整列した胚にそっと押し付け、胚の入ったカバースリップを乾燥剤の入った箱に移します。それらの上にハローカーボンオイルを追加します。胚をマイクロインジェクションするには、まず伸ばしたピペットを使用して2マイクロリットルのDNAを針にロードします。

整列した胚をハロカーボンオイルで倒立顕微鏡下に置きます。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、胚の後端に針を挿入します。フットコントロールで、DNAを胚に慎重に注入します。

最初の胚のマイクロインジェクションが完了したら針を取り外し、次に次の胚の後端に移動します。注入した胚を寒天プレートに移し、インキュベーションします。卵が孵化したら、食べ物の入ったバイアルを準備します。

バイアルに蒸留水を数滴加えます。実体顕微鏡と絵筆で、孵化した幼虫を集め、バイアルに移します。バイアルを摂氏25度、湿度50〜60%で10日間インキュベートします。

過度に乾燥した胚は変形して見え、マイクロインジェクションには使用できません。乾燥不足の胚は、穿刺すると大量の細胞質を漏出させ、生存率を低下させました。適切に乾燥させた胚は、注入されたときに少量しか漏れませんでした。

胚マイクロインジェクションに用いたphiC31インテグラーゼを発現するショウジョウバエの系統は白目でした。この遺伝子型の老齢ハエは、眼に特異的に発現する赤色蛍光タンパク質の蓄積から生じるピンク色の目をしています。橙色の目を持つattP2ドッキング部位に導入遺伝子を持つトランスジェニックフライが作製に成功しました。