The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1.実験の設定<ol><li> 昆虫館の要件 <ol><li>すべてのC.を維持25℃、湿度65％および12/12時間の明/暗の光でcapitataのライフステージ。 </li><li> 6 Lケージには約1,500〜2,000チチュウカイミバエ蛹を置きます。産卵42を刺激するのに十分に小さい穴を有する一方の側に真鍮メッシュでケージを使用してください。毛細管現象により水でハエを提供するために、ケージのベースにある小さい開口部からスポンジ片を挿入します。大人（ 図1A）のための食料源として酵母と砂糖（1:10）の混合物を使用してください。酵母の量を増やします（最大1：砂糖：3、酵母）メスは卵を産むために失敗する必要があります。 </li><li>メッシュを通して堆積卵を収集するために、ケージの下に水で満たされたプレートを置きます。処女雌が産卵することができるようにハエがマイクロインジェクション実験のために卵を収集する前に、少なくとも6〜7日間経過するまで、待ちます。これは、女性が交尾しているであろうことを保証しますそして卵が受精されているであろうこと。 </li><li>細かいネットストレーナーで水を濾過することによって卵を収集します。標準の幼虫の食（1.5 LH 2 O、100ミリリットルを1％HClを含有するプラスチック製の箱にストレーナから卵を移す広域スペクトル抗菌剤は50ミリリットルのエタノールに溶解した5グラム、400グラムの砂糖、175グラムの脱イオンビール酵母、1パスツールピペットを使用して）軟質小麦ふすまをkgです。 </li><li>空気の循環を可能にするために、ネット蓋を透明容器内の各ボックスを配置し、ふすまの層を含有する蛹化（ 図1B）を有利にします。 </li><li>約10日後に、幼虫の食物から出てくると蛹化のためのふすま層に飛び降りる第3齢幼虫を確認してください。 </li><li> 24時間後、柔らかいブラシを使用して、小さなカップに蛹を収集し、新しい大人のケージに転送します。大人は通常10日蛹化後に出現します。新興フライはptilinum、目の上にその頭の上に位置して膨らませてポケットを使用していますアンテナの電子ベースは、蛹殻の終わりを強制的にオフにします。出現した後、ptilinumは恒久的に頭の中に戻って崩壊します。 </li></ol></li><li> マイクロインジェクション幼虫のため1 Lの食品の調製 <ol><li> 300ミリリットルのH 2 Oに2.5グラム寒天を溶かし</li><li>ホット撹拌プレート上のウォーム500ミリリットルのH 2 Oおよび4グラム安息香酸ナトリウム、4.5ミリリットル37％HClを、42グラムの酵母エキスと115グラム脱水ニンジン粉末を溶解します。 </li><li>混合物に10ミリリットルの無水エタノールに溶解した2.86グラム広域スペクトル抗菌剤の溶液を加えます。 </li><li> 15センチメートルラウンドペトリ皿に培地を配布し、放冷します。必要に応じて、4℃で保存します。 </li></ol></li><li> スライドの準備 <ol><li>顕微鏡スライド（75×26ミリメートル2）に両面テープの2cmのストリップを置き、油スプレッドと注入された胚の結果としての乾燥を防ぐために、中国のマーカーでエッジをマークします。 </li></ol></li><li><st栄&gt;核酸の準備<ol><li>市販のキット34を用いてプラスミドDNAを単離します。エタノールを用いてプラスミドを沈殿させ、所望の濃度で注射用緩衝液（0.1 mMリン酸緩衝液pH 7.4、5ミリモルのKCl）中に再懸濁します。 </li><li>フェノール-クロロホルムを使用して、長いdsRNAを合成し、in vitroで精製、イソプロパノールを用いて沈殿させ、注入バッファ43に再懸濁します。 </li></ol></li></ol> 2.胚の準備<ol><li> 6-7日齢の成人を含むケージの下に水で満たされたトレイを置きます。 </li><li>女性は30分間産卵した後、細かいストレーナーを用いて水を濾過することによって胚を収集することを許可します。常に胚の乾燥を避けるために、水にストレーナを保ちます。 </li><li>商業50％の漂白剤溶液中に5秒間ストレーナを浸すことにより、胚をDechorionate。 </li><li>少なくとも、（繰り返しきれいな超純水にストレーナを浸すことにより、慎重に胚を洗います4-5回）。最後に、きれいな超純水にストレーナを配置します。最大2時間以内に胚を使用してください。 注：マイクロインジェクションのタイミングは、前細胞化の核分裂の段階の間に、前胚盤葉の胚に注入する必要性に関連しています。これは、注入されたDNAを採取アップする核に、具体的に配偶子を発信します始原生殖細胞核の中にできます。チチュウカイミバエ細胞化に9と12時間45,46との間で行われるのに対し、 ショウジョウバエでは、極細胞で細胞化は、胚盤葉の形成は、約30分後に44を発生すると、（25℃）受精後約90分で開始します。 </li><li> 行の胚の向き <ol><li>細かい絵筆を使用して、約50の胚を収集し、水に浸した黒濾紙ディスク上に置きます。 </li><li>解剖実体顕微鏡下では、両面テープの上面の上の行の胚を手配細かい絵筆（000）を使用して、顕微鏡スライド（ 図1C）。 注：注射は生殖系列の始点となる後極で行われているように、すべて同じ向きで胚を合わせます。後極は卵門領域に対向します。 </li><li>油は（1.3を参照）中国のマーカーの境界線上にこぼれないことを確認してクロロトリフルオロエチレン油の層で胚をカバーしています。 注：油で胚をカバーする前に、更なるステップを行うことができる：胚は、その液体の含有量を減らすため、注入されたDNA溶液の侵入を容易にするために、数分間乾燥させることができます。これは、高い液体圧力の結果として、注射または注入溶液の過度の漏洩時​​の胚の破裂を回避するのに役立つことがあります。 </li></ol></li></ol> 3.胚のマイクロインジェクション<ol><li>マイクロピペットを用いてプラスミドDNAまたはdsRNA溶液（1-2μgの/μl）を用いて、針（1-2μl）を入力します。 </li><li&gt;が噴射時間（0.5秒）を制御するマイクロインジェクション装​​置に針を接続し、圧力（800ヘクトパスカル）と背圧（150ヘクトパスカル）。 </li><li>針（ 図1D）の動きを制御するためにマイクロマニピュレーターを使用して、実体顕微鏡下でマイクロインジェクションを実行します。スライドを移動するために顕微鏡ステージを使用してください。 <ol><li>スコープのステージ上にスライドを置きます。 </li><li>胚（ 図1E）の後極に針の先端を挿入します。 </li><li>ペダルとマイクロインジェクションシステムを作動させることによって溶液を注入します。注入された液体は、胚のわずかな動きで、その結果、内部圧力の増加を誘導します。 </li><li>ペダルを離すとすぐに、しかし優しく、胚から針を取り除きます。 </li><li>注射部位のほとんどの細胞質の漏れを確認します。 注：原因マイクロインジェクションプロにDNA / dsRNAは/ siRNAおよび死亡率の潜在的な致死効果とを区別するために、自身cedure、対照実験を実施しなければなりません。これらは、逆遺伝学実験の場合には、緩衝液のみの注入を含む、または、緑色蛍光タンパク質（GFP）の二本鎖RNA（dsRNA-GFP）、またはsiRNAの由来。 </li></ol></li><li>注射後25℃で胚をインキュベートします。 </li></ol> 4.注入後の手順<ol><li>注入の2日後、実体顕微鏡下で孵化した幼虫（ 図1F）のためのスライドを確認してください。幼虫は、油に移動するが、できるだけ早く幼虫食品に転送する必要があることができます。このため、スライドを数回日をご確認ください。 </li><li>細かい絵筆（000）を使用して、静かにニンジンベースの幼虫食品に孵化した幼虫を移します。各ペトリ皿当たり200幼虫の最大値まで転送します。 </li><li>湿度65％（25℃）で幼虫をインキュベートします。空気交換を損なう、蓋が皿に固執しないことを確認してください。 </li><li>蓋をペトリ皿にしてください幼虫への空気の流れがまだあるように、ほとんど閉じました。過度の乾燥を避けるために、必要に応じて、毎日の料理をチェックし、蒸発を補うために水を追加します。 </li><li>ネット蓋と蛹化を有利に働くふすまの層を含むことにより、閉じた透明容器にペトリ皿を置きます。ルーチン昆虫館飼育については、 第3齢幼虫の幼虫の食のうち、ジャンプとはふすまで蛹になります。 </li><li> （これは世代0、G0）で蛹を収集し、大人の飼育およびスクリーニングのための小さなケージに配置します。リア標準幼虫食品に子孫。 </li><li>注入された個人は、通常、キメラあるとして生殖形質転換実験の場合には、次の世代（G1）で可能な形質転換された個人のために確認してください。転位事象は、確かに、生殖細胞系または細胞体のいずれかを形成する胚の合胞体、核のいずれかに発生した可能性があります。 <ol><li>まもなく出現した後、CO 2を使用して、G1の個人を麻酔し、TRANSFをチェック落射蛍光実体顕微鏡下でのイベントをormation。緑色蛍光のために画面にEYFPフィルタ（。。;エム30分の535内線500/20）を使用しながら、; DsRedwideフィルタ（EMM 75分の605。。内線12分の546）を使用し、赤色蛍光の存在をスクリーニングするために、 。 </li><li>異性の野生型大人と小さなケージに変換された個人を置き、新しい、最初はヘテロ接合、歪みを発信。 </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

昆虫の胚中の核酸のマイクロインジェクションは、遺伝子機能の解析とバイオテクノロジーのアプリケーションの両方を容易に普遍的な技術です。 昆虫の種数の増加から、ゲノム配列の最近の刊行物は、まだ未知の機能の遺伝子の機能解析のためのツールのための緊急の必要性につながります。 RNA干渉は、分子機能49と胚のマイクロインジェクションを推測する...

地中海ミバエは（チチュウカイミバエ）Ceratitis capitataはコスモポリタン種広範囲に被害果物や栽培作物です。このような属BactroceraやAnastrephaに属するものなど、いくつかの害虫種を含み、ミバエ科のファミリーに属します。チチュウカイミバエは、このファミリーの最も研究の種であり、それは昆虫の侵略1の研究のためだけでなく、害虫管理戦略2を最適化するためだけでなく、モデルとなっています。 チチュウカイミバエは野生と栽培植物3,4の300以上の種を攻撃することができます多化の種です。損傷は大人と幼虫の両方によって引き起こされる：交配した雌は、微生物がそれらの商業的品質に影響を与えることができるように、産卵のために果物の表面に穴を開け、果肉上の幼虫フィード一方。 3幼虫期の後、幼虫は、ホストから出てくると土壌に蛹化。Ceratitiscapitataは、アフリカ、中東、西オーストラリア、中南米、欧州、米国5の領域を含む、ほぼ世界的な分布を表示します。 チチュウカイミバエ蔓延を制限するための最も一般的な戦略は、殺虫剤（ 例えば 、マラチオン、スピノサド）と環境に優しい滅菌昆虫技術（SIT）6の使用を伴います。後者のアプローチは、電離放射線への暴露により無菌に男性の数十万の野生への放出を伴います。野生のメスのような滅菌男性の交配は、最終的に根絶につながる、人口規模の縮小を引き起こし、ノー子孫になります。 SITは、世界中の複数のキャンペーンに有効であることが証明されたが、その主な欠点がリリースされる昆虫の何百万人を飼育し、殺菌の高コストが含まれます。放出された個人のマーキング中にフィールドに入力された野生昆虫から無菌区別する必要があります活動を監視し、それが現在の蛍光粉を使用して達成されます。これらの手順は、高価であり、望ましくない副作用7を持っています。 最適化するために、および/または、この害虫の制御のためのより効果的なアプローチを開発するためには、チチュウカイミバエ生物学と遺伝学は広く世界中で数多くの研究者によって検討されています。チチュウカイミバエゲノム配列8,9の利用可能性は、遺伝子機能に関する新たな調査を容易にするであろう。 RNA干渉は、そのような研究のための強力なツールであり、それは、dsRNA（二本鎖RNA）又はsiRNA（低分子干渉RNA）の微量注入を介して達成することができます。この技術は、Cでその性別決意分子カスケードを実証するために、例えば、使用されていますcapitataは部分的にしかショウジョウバエ 10とに対して保存されています。 C.許可チチュウカイミバエ胚を顕微注入するためのプロトコルの開発最初の非すべきcapitata-Drosophilidフライ種は遺伝的に改変されます。その卵は、 ショウジョウバエと同様であり、両方の形態および乾燥11への耐性の観点から、プレ胚盤葉の胚にプラスミドDNAを送達するためのプロトコルは、最初のDのために開発されたようにショウジョウバエ 12,13 最初にCでの使用に適合しましたcapitata。これらの最初の実験は、転移因子ミノス11に基づいて、チチュウカイミバエ生殖変換を可能にしました。その後、元のシステムは、他のトランスポゾンベースのアプローチを用いて、14変更されました。これは、鱗翅目Trichoplusianiの 15からのpiggyBacの場合です。プロトコルは、以来、さらに最適化されており、これは他の多くの双翅目22-31の他tephritid種16-21の変換とを可能にしました。人工欠陥transpo：すべてのこれらのシステムは、一般的なバイナリーベクター/ヘルパープラスミドの形質転換系の使用に依存します所望の遺伝子を含有する息子は、プラスミドDNAに組み込まとトランスポザーゼ酵素32を供給することにより、昆虫のゲノムに組み込まれています。トランスジェニックチチュウカイミバエ行数は、精度を高める可能性がある、致死性を誘発する条件優性致死遺伝子を有する株、株の雄のみの子孫を生成するため、追加の雌雄鑑別戦略を必要としない、蛍光精子で株を含む複数の機能で、生成されましたSITの監視段階33-37の。トランスジェニック生物の野生でのリリースのみ38,39蚊に対するパイロットテストで発生したが、少なくとも一つの会社は、フィールド40での使用のためのトランスジェニックチチュウカイミバエ株の数を評価しています。 胚のマイクロインジェクションは、（CRを、このような転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピートなどの新しいゲノム編集ツールの開発に有利に働くことができますISPR）/ CRISPR関連タンパク質小説進化論と発達研究を可能にするだけでなく、利用可能なバイオテクノロジーのツールボックスを展開します9ヌクレアーゼ（Cas9）とホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子（HEGs）、。ゲノム編集アプローチはすでに蚊41における遺伝子ドライブシステムの生成を可能にし、チチュウカイミバエへの転送が目前に迫っています。ここでは、上記のすべてのアプリケーションに有用であることができるチチュウカイミバエ胚に核酸を微量注入のための普遍的なプロトコルを記述します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 x injection Buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Buffer</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Construct Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Helper Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dsRNA</td>
			<td style="width:107px;">RNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Phenol-Chloroform purified</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Standard Larval food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing Food&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products&#160; dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#8217;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Carrot Larval Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>yeast extract and sugar (1:10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z692247</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection needles&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956000</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloaders</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double slided tape</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Whatman Black circle paper</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:107px;">Generic reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Diluite 1:2 before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paintbrush (000)</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-153</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult cages</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:107px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ceratitis capitata</td>
			<td style="width:107px;">Animal</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">The strain used is ISPRA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

地中海ミバエ（チチュウカイミバエ）Ceratitis capitata（ヴィーデマン）（双翅目：ミバエ科）は非常に高い農業関連性を持つ害虫種です。これは、その生殖行動に起因している：彼らはパルプに卵や孵化した幼虫のフィードを置くとき、女性は果物や野菜の外表面に損傷を与えます。ワイルドC. capitata集団は、伝統的に噴霧および/または環境に優しいアプローチは、最も成功したが、無菌昆虫技術（SIT）である殺虫剤を介して制御されています。 SITは交尾する能力を保持するが、肥沃な子孫を生成することができません男性の大量飼育、放射線ベースの殺菌・フィールドリリースに依存しています。出現およびバイオテクノロジーのツールのその後の急速な発展は、一緒にチチュウカイミバエゲノム配列の可用性と、大幅にこの種の生物学の我々の理解を後押ししています。これは、ゲノム操作のための新しい戦略の増殖を支持しているCAnは集団制御に適用します。 この文脈では、胚のマイクロインジェクションは、チチュウカイミバエ制御のためのツールボックスの拡大に二重の役割を果たしています。キー生物学的プロセスを調節する遺伝子の機能を妨害する能力は、確かに、チチュウカイミバエ侵襲性の根底にある分子機構の理解を拡張します。さらに、生殖系列形質転換を達成する能力は、新規SIT設定将来フィールドアプリケーションについて試験することができる複数のトランスジェニック株の産生を促進します。実際、遺伝子操作は、例えば、フィールド内の滅菌男性パフォーマンスを監視するために使用することができる望ましい特性を付与するために使用することができ、またはそれは、初期の生命段階の致死をもたらすことができます。ここでは、これらの二つの主要な目標を達成するためにチチュウカイミバエ胚に核酸を顕微注入するための方法を記載します。

ここでは、それぞれ、目的の遺伝子の機能解析に向け胚のマイクロインジェクションの二つのアプリケーション（ケース1）を報告し、およびトランスジェニック株の世代（ケース2）で。 胚へのdsRNAの送達は、遺伝子機能を解明します。 innexin-5遺伝子は、昆虫では、男?...

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K ビュー.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

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The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to particular habitats and management practices. This article shows how certain terroir signatures can be detected in the berry metabolome and transcriptome of the grapevine cultivar Corvina using multivariate statistical analysis. The method first requires an appropriate sampling plan. In this case study, a specific clone of the Corvina cultivar was selected to minimize genetic differences, and samples were collected from seven vineyards representing three different macro-zones during three different growing seasons. An untargeted LC-MS metabolomics approach is recommended due to its high sensitivity, accompanied by efficient data processing using MZmine software and a metabolite identification strategy based on fragmentation tree analysis. Comprehensive transcriptome analysis can be achieved using microarrays containing probes covering ~99% of all predicted grapevine genes, allowing the simultaneous analysis of all differentially expressed genes in the context of different terroirs. Finally, multivariate data analysis based on projection methods can be used to overcome the strong vintage-specific effect, allowing the metabolomics and transcriptomics data to be integrated and analyzed in detail to identify informative correlations.

This article describes the application of untargeted metabolomics, transcriptomics and multivariate statistical analysis to grape berry transcripts and metabolites in order to gain insight into the terroir concept, i.e., the impact of the environment on berry quality traits.

グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

遺伝学

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

家畜接合体におけるレーザーアシスト細胞質マイクロインジェクション

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

細胞遺伝学的手法を用いたタバココナジラミの卵の受精率を決定します。

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the others contain 5&#39; monophosphate generated post-transcriptionally (processed transcripts). To discriminate between the two types of transcripts, several strategies have been developed, and most of them depend on presence/absence of 5&#39; triphosphate. However, the triphosphate at primary 5&#39; termini is unstable, and it hinders a clear discrimination of the two types of transcripts. To systematically differentiate and map the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion, we have developed a circular RT-PCR (cRT-PCR)-based strategy by combining cRT-PCR, RNA 5&#39; polyphoshpatase treatment, quantitative RT-PCR (RT-qPCR), and Northern blot. As an improvement, this strategy includes an RNA normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate.
In this protocol, the enriched mitochondrial RNA is pre-treated by RNA 5&#39; polyphosphatase, which converts 5&#39; triphsophate to monophosphate. After circularization and reverse transcription, the two cDNAs derived from 5&#39; polyphosphatase-treated and non-treated RNAs are normalized by maize 26S mature rRNA, which has a processed 5&#39; end and is insensitive to 5&#39; polyphosphatase. After normalization, the primary and processed transcripts are discriminated by comparing cRT-PCR and RT-qPCR products obtained from the treated and non-treated RNAs. The transcript termini are determined by cloning and sequencing of the cRT-PCR products, and then verified by Northern blot.
By using this strategy, most steady-state transcripts in maize mitochondrion have been determined. Due to the complicated transcript pattern of some mitochondrial genes, a few steady-state transcripts were not differentiated and/or mapped, though they were detected in a Northern blot. We are not sure whether this strategy is suitable to discriminate and map the steady-state transcripts in other plant mitochondria or in plastids.

We present a circular RT-PCR-based strategy by combining circular RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5&#39; polyphosphatase-treatment, and Northern blot. This protocol includes a normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate, and it is suitable for discriminating and mapping the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion.

円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...