このプロトコルは、一般的な遺伝子工学技術を使用して変換することが歴史的に困難であったアノフェレスガンビアに特異的なマイクロインジェクション方法を提供するため、重要です。この技術の主な利点は、トランスジェニックアノフェレスガンビアを確実に作成する点です。この技術の応用は、集団の抑制や野生型アノフェレスガンビア集団の改変に適した蚊の作成を促進することにより、マラリア撲滅のための新しい戦略にまで及ぶ。
この方法論は、異なる蚊種に容易に適応することができる。マイクロインジェクション技術は、忍耐と実践を必要とします。学習曲線があります。
まず、吸引器を使用して、透明な50ミリリットルの円錐管に20〜30匹のメスを入れる。チューブが両端で切り開き、一方の端にラテックス歯科フィルム、もう一方の端にナイロンメッシュとフィルターペーパーで覆われ、蚊が卵を産みます。蚊で満たされたチューブを二重蒸留水で満たされた小さなペトリ皿に入れ、チューブと皿を28°Cのインキュベーターに45分間置きます。
チューブをインキュベーターから取り出し、チューブを空のケージに挿入します。チューブを軽くたたいて、蚊が飛び出します。すべての蚊が飛び出したら、ケージからチューブを取り外します。
チューブに蚊が含まれず、下のリングを緩め、ナイロンを取り外し、鉗子を使用して卵をチューブから慎重に取り除きます。卵を含んだろ過紙を水で湿らせたろん紙の層を含むプラスチックペトリ皿に入れます。きれいなガラススライドに膜を置き、きれいな鉗子を使用して膜をフィルターペーパーで覆い、約1ミリメートルの膜フィルターを覆い残します。
フィルターペーパーを脱イオン水で濡らし、ブラシを使用して30〜50個の胚を膜の端にそっと移し、卵を膜に沿って垂直に整列させます。卵がマイクロインジェクション顕微鏡で観察されるとき、後端が下の位置にあり、針で15度の角度を形成するように、卵を同じ方向に向けます。膜の縁全体を卵で並べます。
マイクロローダーチップを使用して、2マイクロリットルのDNA混合物で針を充填します。針ホルダーに針を差し込み、自動圧力ポンプチューブを接続します。針をスライドの平面に合わせて 15 度の角度になるように調整します。
最初の卵に注意して針先を開き、針の先端を後極に約10マイクロメートルに挿入します。注射が成功すると、卵の中の細胞質の小さな動きにつながります。顕微鏡同軸ステージコントロールを使用して、次の卵に移動して注入を継続します。
針先が開いたままで詰まっていないようにするには、別の胚に入る前に[注射]ボタンを押して、針の開口部にある小さな液滴を視覚化します。針が詰まったら、[クリア]ボタンを押して針をクリアし、液滴の可視化テストを繰り返します。針先の開口部が少し大きくなる場合は、必要に応じて圧力を調整し、液滴のサイズが小さく保たれるようにします。
1針で約40~50個の卵を注入します。注射が完了したら、フィルターペーパーが並び、50ミリリットルの脱イオン水で満たされたガラス容器に卵をすすぐ。このプロトコルを用いて、アノフェレスガンビアの実験室株G3の生殖細胞系列に自律遺伝子駆動系を挿入した。
このシステムは、この種の第3染色体の枢機卿オルソログ(Agcd)を標的とするように設計された。プラスミドpCO37を示す。これは、ナノ遺伝子オルソログの調節要素の制御下にレンサ球菌のpyogenesCas9エンドヌクレアーゼが含まれています。
さらに、U6遺伝子プロモーターの制御下にガイドRNAとシアン蛍光タンパク質を発現する3XP3 CFPのCFP優位マーカーカセットを有する。分子アプローチは、AgNosCd-1と指定された約10キロの塩基対DNAの正確な挿入を検証した。広範なフォローアップ分析は、AgNosCd-1が駆動において非常に効率的であり、抵抗性対立遺伝子をほとんど作り出さなかったこと、および遺伝子駆動系の統合および発現のために大きな遺伝的負荷を持たなかったことを示した。
蚊を含むホモ接合遺伝子ドライブは機能喪失変異体であり、幼虫、子犬、および赤目表現型を有する新たに出現した成人であった。このプロトコルを試みるとき、88で保つことは、灰色の卵を明るくし、白い卵を避けるために良い孵化のために重要です。
