Name: sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

著者らは、ヴァネッサ・メルデナー=ハレルが原稿を批判的に読んでくれて感謝している。

砂のフライの供給のための血液源としてマウスを使用するは、国立衛生研究所(NIH)の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に従って厳格に行われました。このプロトコルは、NIAID NIH(プロトコル番号LPD 68E)の動物管理および使用委員会によって承認されました。無脊椎動物はNIHガイドラインの対象とはなりません。
1. 針の準備 (図 1)
<ol><li>ムーティとハレル19に記載されているように針とベベルを引っ張ります。簡単に言えば、二段ガラスのマイクロピペットの引き手に針を引っ張り、ホウケイ酸ガラスの毛細血管を使用する。</li>
	<li>余分な細かい石を使用して、マイクロピペットベベラーに濡れたベベルで針を研ぎます。</li>
</ol>2. 胚の収集とマイクロマニピュレーション (図 2)
<ol><li>注射日の5日前に、血中の砂はコロニー維持のために日常的に行われるように雌を飛ばす。サンドフライコロニーの飼育手順および必要な材料については、Lawyerら.1インキュベーターの昆虫を湿度70%、26°Cで全開発中に維持する 方法をご覧ください。<ol>
<li>ある日、血液を摂食後、サイドポート付きの石膏ポットで100-150のグループによって血液供給された女性を捕獲する。コロニーのメンテナンスのために通常、糖溶液(30%スクロース - 小さな綿のボールを浸すのに十分な量)でそれらを供給することによって、女性を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3日目の送血後は、石膏ポットを湿らせないでください。乾燥した基材にメスを保つことは、女性が湿った環境で卵を産むことを好むので、早期産を防ぎます。</li>
	<li>5日目の送食後に、胚の採取、微小改分、および微小注射を行う。産卵室に湿ったろ紙を導入します。寝たての胚は完全に発達した絨毛を持たず、白く見える。白い胚の視覚化を容易にするために手順の間に黒いろ紙を使用してください。</li>
	<li>口の吸引器を使用してサイドポートを介して産卵室に石膏ポットから女性の小さなグループを転送します。湿った基質(ろ紙)の存在は、オビポジットに女性を誘導する。</li>
	<li>30〜60分後、チャンバーから新しく敷設された胚で濾紙を慎重に取り出します。濾紙と胚をペトリ皿に3時間まで保管します。この間、定期的にフィルターペーパーの水分レベルを評価して、湿った状態を保つようにします。この間、女性の新しいグループでステップ2.4〜2.6を繰り返し、できるだけ多くの胚を収集します。</li>
	<li>注入のための顕微鏡のスライドを準備する:手動で非常に細かい絵筆で卵を一つずつ収集し、慎重にガラスカバースリップをトッピング顕微鏡スライドに置かれた湿った黒いフィルター紙の別の部分にそれらを転送します。<ol>
<li>濾紙に水を加え、胚を湿らせたままにするのに十分ですが、カバースリップから離れたり、カバースリップの下に吸い込まれたりしないようにします。カバースリップに対して胚を並べる。カバースリップは、注射中に卵が転がり落ちるのを防ぐバックストップとして機能します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 胚注射 (図 3)
<ol><li>卵の収集開始後2.5〜3時間の注射を開始します。室温および周囲の実験室の湿気で注入を行う。</li>
	<li>整列した胚が湿った状態に保たられるように十分な水を持っていることを確認してください。 注:注射中に胚を湿らせておくのが重要です。注射工程で湿っていないと、注射は、針が胚を突き刺すのに問題があるため困難になる。正しい量の水は、胚が周囲に半月板の水を持っている点ですが、カバースリップは水の上に浮かばず、胚がカバースリップの下に押し込みます。注射中に胚の周りの水の量を監視することが重要です。必要に応じて水を加え、胚を湿らせた状態に保ちます。</li>
	<li>ブラシを水で濡らし、濾紙の裏端に水を移して、慎重に水を加えます。この方法で水を追加すると、ゆっくりと制御された方法で水を追加できるため、胚を湿らせ続けるのに十分な量が追加されます。水が多すぎると胚が整列して浮き出てしまい、胚を注入するのが難しくなる。</li>
	<li>バックロード注入はマイクロインジェクション針に混入する。手描きのホウケイ酸ニードルフィラーを使用して、約0.5〜1μLの注射ミックスを針に加え、ゲルローディングピペットチップも使用できます。この注入ミックスは、市販の組換えCas9タンパク質(300 ng/μL)と混合した特定の遺伝子座を標的にするように設計された1つまたは複数のガイドRNA(それぞれ80 ng/μL)で構成されています。</li>
	<li>射出圧力を30 psiから始め、注射トリガを押して針の先端から空気を排出します。これにより、注射ミックスが流れるよう注射の針先に強制的にします。この時点で、注入材料が流れ始めるまでホールド/定圧をゆっくりと上げ、針から流れる注入ミックスのポイントのすぐ下になるようにホールド/定圧を下げます。ゲート設定は、少量の材料が胚に入るのを見ることができるように、十分な注入材料を提供する必要があります。 注: ショウジョウバエ や蚊に使用される他のプロトコルと同様のハロカーボンオイルの下での砂フライ胚の注入は、最初はテストされましたが、これらの注射の生存率は非常に低かった。上記のように湿った濾紙上の注射に切り替えることによって生存率が向上した。</li>
	<li>胚の側面に針を挿入します。胚を突き刺すために針を助けるバックストップとして胚の後ろのカバースリップを使用してください。針を穏やかに取り除く前に、少量の注射ミックスを胚に送り込みます。</li>
	<li>針を取り外した直後に、注射器を押して、針先から詰め戻り材料を取り除きます。これは、針が詰まるのを防ぐのに役立ちます。</li>
	<li>次の胚に進みます。各注射の間に、濾紙が湿っていて、針が詰まっていることを確認してください。</li>
	<li>すべての胚が注入されたら、注入された胚の数を数え、ランニング集計を維持します。</li>
	<li>カバースリップが浮くように濾紙に水を加えてカバースリップを取り外します。この時点で、プローブ(昆虫のピンを先端に接着した木製アプリケータースティック)を使用してフィルターペーパーを所定の位置に保持し、指を使用して注入された胚からカバースリップを引き離します。</li>
	<li>カバースリップが取り除かれたら、濾紙から余分な水を消します。</li>
</ol>4. 射出後の飼育 (G0)(図 4)
<ol><li>湿った濾紙のいくつかの層の上に胚を入れた濾紙をペトリ皿に入れ、湿度を維持します。他の胚を注入するために必要な時間の間、胚をここに保管してください。胚は、このような最大3時間保持することができる。注射後、彼らはゆっくりと茶色になります。</li>
	<li>すべての胚が注入されたら、手動で以前に湿らせた小さなサイズの石膏ポットに移します。各ポットにあまりにも多くの胚を入れて、それらの間の距離を維持しないでください, 個人間の可能な真菌汚染を避けるために.鍋をスクリーンで覆い、開発全体の間に湿度70%と26°Cのインキュベーターに維持されるサンドフライコロニーの卵のために通常行われるようにそれらを保存します。</li>
	<li>1日目の注射後、損傷した胚と死んだ胚をすべてペイントブラシで取り除きます。0.5%プロピオン酸の100 μLを加えて、注入された胚を含む石膏ポットに滴下して、真菌汚染を制限します。注射プロセス中に損傷を受けた胚からの細胞質の放出は、真菌の成長に特に有利である。</li>
	<li>毎日石膏ポットをチェックし、悪いまたは死んだ胚を削除します。真菌が存在する場合は、感染したすべての胚を除去し、0.5%プロピオン酸の数滴を追加します。</li>
	<li>8日目から12日目の注射後の幼虫ハッチ。1日2回、新たに出現した幼虫を5〜10のグループで新しい石膏ポットに移します。少量の食べ物を加え、週に2〜3回食べ物をチェックしてください。<ol>
<li>幼虫の食物の量を注意深く監視し、真菌汚染のリスクを大きく高めます。サンドフライ幼虫は、十分な食べ物がない場合、彼らはカニバリズムすることができますが、グループでより良い生き残ることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>幼虫が子犬になると、女性を処女として維持するためにセックスでそれらを分離します。生存者が多い場合は、男性を捨て、メスだけを飼います。 注:男性と女性の両方が突然変異を運ぶことができ、送信することができます。しかし、メスは渡る前に処女を保たれなければならないので、セックスによってwt昆虫を分離することを避けるためにG0 注入された女性だけを使用する方が簡単です。成人の生存者の数が少なく、この場合、ソートされたwt処女女性と交配される場合、G0 の男性はバックアップとして保持することができます。</li>
</ol>5. 変異型対立体の選択とスクリーニング (図5)
<ol><li>ケージ内のwt雄を持つG0 メスをマスクロスする。通常のコロニーの維持のために行われるように、それらを完全に供給する血液。</li>
	<li>1日は、授乳後、口の吸引器を使用して個々の石膏チューブに個々の石膏チューブに2〜3重量の男性と各G0 メスを転送します。毎日変わった小さな綿のボールに砂糖でハエを養い、石膏の水分が産卵に適していることを確認するために水の注射器を使用しています。</li>
	<li>G0 メスが卵を産んだ後(G1に対応)、後のジェノタイピングのために個々の、アノゲートされたエペンドルフチューブに体を集める。通常のwtコロニーに対して行われるように胚を維持する。</li>
	<li>選択した方法によりG0 メスからDNAを抽出する。</li>
	<li>例えばCRISPRカットの予想領域を取り巻くプライマーを用いたPCRアッセイを設計することにより、変異の存在を求めてDNAをスクリーニングする。</li>
	<li>変容の証拠を示すG0メスによって敷設されたG1胚のみを保管する。これらのG1胚が子犬に発達する場合は、性別によってそれらを分離し、メスだけを保つ。同じG0メスからwtの男性にG1メスを渡り、それらを血液中に供給し、2〜3人の女性と4〜5人の男性の小グループで小さなサイズの容器に移します。 注:すべてのG1 個体はユニークな突然変異を運ぶ機会があるので、生き残った個体の数が高すぎない場合は、G1 メスをwt男性と個別に横断する方が良いです。同じチューブに異なる突然変異を運ぶ複数の雌の場合はまれであるが、発生する可能性があります。このような場合、ジェノタイピング後に観察された場合、G2 子孫の女性は、wt雄に個別に交配する必要があります。この交配スキームは、子孫における複数の突然変異の可能性を回避する。</li>
	<li>産卵後、G1 メスの体を収集し、突然変異のためにそれらをスクリーニングします。少なくとも1人の女性が突然変異の証拠を示した管だけを保管してください。</li>
	<li>後の世代のために単一のペアをクロスします。産卵後、両親が突然変異の存在をスクリーニングする。両親が同じ突然変異のためにホモ接合体になるまで、各世代で繰り返します。一度特定されると、彼らはホモ接合突然変異株の創設者になります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae).">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42 (2017).</li><li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9:+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells.">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li><li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival.">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li><li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. 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ここでは、フレボトムスパパタシサンドハエでCRISPR/Cas9による標的性変異誘発のための最近開発された胚微小注射法を紹介する。昆虫遺伝子改変のための胚微小注射は、1980年代半ばにショウジョウバエで開発され、現在では多種多様な昆虫に日常的に使用されています。遺伝子組み換え物質の送達のための他の方法は、例えばReMOT20、21、22...

ベクター媒介性疾患は、絶え間ない進化における公衆衛生上の大きな脅威です。世界保健機関(WHO)によると、非常に異なる系統形成家族(蚊、ダニ、ノミなど)に広がる何百ものベクター種が膨大な数の微生物病原体の伝染を引き起こし、その結果、年間70万人以上の人が死亡する。ベクター昆虫の中で、フレボトミン砂ハエ(ディプテラ、サイコディダエ)は広大な群を構成し、80種の実証済みベクター種が異なる地理的領域で見られる明確な現象学的形質およびベクター能力を示す。彼らは リーシュマニア属の原虫寄生虫のベクターであり、リーシュマニアーゼの約130万人の新しい症例を引き起こし、年間約20,000〜30,000人の死亡を引き起こす。リーシュマニアーゼ臨床転帰は多様であり、自己制限的な皮病変から治療がない場合には致命的な内臓播種に至るまで症状が広がる。
砂のハエは厳密に地上の昆虫です。他のディプテラと比較して比較的長いライフサイクルは、温度、湿度、栄養などの異なるパラメータに応じて、最大3ヶ月間続きます。それは1つの胚段階(6〜11日)、4つの幼虫段階(合計23〜25日間持続する)と1つのプパル段階(9〜10日)とそれに続く変態と成人から構成される。砂のハエは飼育のために湿気と暖かい環境を必要とします。オスもメスも、花の蜜から野生で得られる糖を食べる。卵の生産のために血液の食事から得られるタンパク質を必要とするので、女性だけが血液供給剤である。
研究の重要な焦点は、伝染性感染症の発症につながるベクター/寄生虫相互作用の性質を特定することです。他のベクター昆虫と同様に、砂ハエに固有のパラメータは、病原体を宿主に運び、伝染する能力として定義されるベクター能力に影響を与えることを示している。例えば、フレボトムス・パパタシサンドフライミドグ細胞によるガレクチンの発現は、寄生虫表面成分を認識する受容体として作用し、リーシュマニアメジャー2,3に対するそれらのベクター能力に直接影響を及ぼすことができる。昆虫免疫応答経路は、免疫不全(IMD)、リーシュマニアメジャー4のフレボトムスパパタシサンドフライベクター能力にも極めて重要である。感染性病原体の伝染を制御するベクター昆虫免疫応答経路の重要な役割は、Aedes aegypti蚊5、6、7、ツェツェフライグロッシナ・モルシタンス8、アノフェレスガンビア蚊9、10でも同様に報告されている。
サンドフライ/リーシュマニア相互作用の研究は、これらの昆虫での使用に適応した遺伝子発現修飾法の欠如によって制限されている。最近まで11、12、13、14の小さな干渉RNA(siRNA)による遺伝子のダウンレギュレーションのみが行われていた。この技術は、成人女性の微小注射に関連する死亡率によって制限され、機能の部分的な喪失しか起こらず、世代から世代へと伝達することができない。
CRISPR/Cas9技術は、砂ハエなどの非モデル生物の機能ゲノム研究に革命をもたらしています。バクテリオファージ15、16に対する防御のために原核生物中の適応免疫系から改変され、CRISPR Cas9システムは昆虫を含む優れた真核生物のゲノム編集ツールとして急速に適応されている。CRISPR/Cas9の標的ゲノム編集の原理は、特定のゲノム遺伝子座に対する単一ガイドRNA(sgRNA)の相補性に基づいています。Cas9ヌクレアーゼはsgRNAに結合し、sgRNAがその相補配列に関連するゲノムDNAに二本鎖DNA(dsDNA)破断を生み出します。Cas9-sgRNA複合体は、sgRNA中の17〜20の相補塩基によって標的配列に導かれ、dsDNAブレークは、次いで2つの独立した経路によって修復することができる:非相同端接合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)17。NHEJの修復は、休憩の単純な閉鎖を伴うが、頻繁に小さな挿入/削除イベントにつながる。HDRによるDNA修復は、ドナーDNA分子共有相同性を標的DNAとの間で修復用のテンプレートとして使用します。昆虫は両方の機械を持っています。
CRISPR/Cas9技術は、NHEJ修復経路を介して、選択された遺伝子座に突然変異を生成することができます。または、適切なドナーテンプレートを使用してHDR経路を介して、ノックインや発現レポーターなどのより複雑なゲノム編集戦略のために。サンドハエでは、免疫応答因子Relishの ヌル 変異対立体が 、フレボトムス・パパタシ4においてNHEJ媒介CRISPRを介して生成された。サンドフライ胚はまた、黄色をコードする遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9ミックスを用いた別の研究で注射された。それでも、突然変異を運ぶ成人は18を産生しなかった。ここでは、NHEJ媒介CRISPR/Cas9による砂飛球標的突然変異誘発の詳細な方法について説明し、特にプロトコルの重要なステップである胚微小注射に焦点を当てる。

<table><tbody><tr><td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td><td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Any brand</td><td></td><td>For aligning embryos</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td></tr><tr><td>Insect cage</td><td>custom made or several commercial options</td><td></td><td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Larval food</td><td>custom made</td><td></td><td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Microcaps 100 ml</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Used to back fill microinjection needles</td></tr><tr><td>Mouth aspirator</td><td>John W. Hock Company</td><td>Model 612</td><td>mouth aspirator with HEPA filter</td></tr><tr><td>Olympus SZX12</td><td>Olympus Life Sciences</td><td></td><td>Microinjection microscope</td></tr><tr><td>Ovipots</td><td>Nalge company</td><td></td><td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Paint Brush 6-0</td><td>Any Art Supply Company</td><td>n/a</td><td>Used for aligning embryos</td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>antifungal agent</td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td>Used for making microinjection needles</td></tr><tr><td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td></tr></tbody></table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

サンドハエは リーシュマニア 種の自然ベクターであり、原虫寄生虫は皮病変から内臓病理に至るまで幅広い症状を生み出す。ベクター/寄生虫相互作用の性質を解読することは、 リーシュマニア の宿主への伝達をよりよく理解するために重要である。砂飛ぶベクトル能力を制御するパラメータ(すなわち、病原体を運び、伝達する能力)の中で、これらの昆虫に固有のパラメータが重要な役割を果たすることが示された。昆虫免疫応答は、例えば、 リーシュマニアに対するサンドフライベクター能力に影響を与える。このようなパラメータの研究は、これらの非モデル生物での使用に適応した遺伝子発現修飾の方法の欠如によって制限されている。小さな干渉RNA(siRNA)による遺伝子のダウンレギュレーションは可能ですが、技術的に困難であることに加えて、サイレンシングは機能の部分的な損失をもたらし、世代から世代へと伝えることはできません。CRISPR/Cas9技術による標的突然変異誘発は、最近 、フレボトムスパパタシ サンドフライに適応した。この技術は、特異的に選択された遺伝子座における転化可能な突然変異の生成につながり、目的の遺伝子を研究することを可能にする。CRISPR/Cas9システムは、後に非相同エンドジョイングレンス(NHEJ)または相同性駆動修復(HDR)のいずれかによって修復されたターゲット二本鎖DNA切断の誘導に依存しています。NHEJは、休憩の単純なクロージャで構成され、頻繁に小さな挿入/削除イベントにつながります。対照的に、HDRは、標的DNAと相同性を共有するドナーDNA分子の存在を修復のテンプレートとして使用する。ここでは、これまでにサンドフライベクターに適応した唯一のゲノム修飾技術であるNHEJを用いたCRISPR/Cas9による標的変異誘発に対するサンドフライ胚微小注入法を提示する。

ここで説明したCRISPR/Cas9マイクロインジェクションプロトコルは、前の出版物4で確立された前の出版物で確立されたサンドフライ変異体を生成する。このアプローチは、540人の個体のうち11人がこの処置を生き延び、そのうち9人が突然変異体であったため、非常に効率的な突然変異誘発を生じさせた。CRISPR/Cas9突然変異のガイドを設計する際、重要な最初のステップは、標?...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

このプロトコルは、胚の採取、注射、昆虫飼育、同定、および目的の突然変異の選択など、砂ハエにおけるCRISPR/Cas9標的突然変異のステップを詳述する。

CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.1K ビュー.  National Institutes of Health. このプロトコルは、胚の採取、注射、昆虫飼育、同定、および目的の突然変異の選択など、砂ハエにおけるCRISPR/Cas9標的突然変異のステップを詳述する。

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

遺伝学

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

ショウジョウバエにおけるphiC31インテグラーゼ媒介胚導入

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

著者スポットライト:ショウジョウバエのトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクションの最適化

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネ ッタイシマカ のゲノム編集

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

行動学

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

要約

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世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネッタイシマカのゲノム編集

CRISPR/Cas9ゲノム編集ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

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ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

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CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネ ッタイシマカ のゲノム編集

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネッタイシマカのゲノム編集

CRISPR/Cas9ゲノム編集ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

トウモロコシウンカ、ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション