この研究は、米国農務省-NIFA 賞 2015 67015 23488 ロジャー ・ コーンによって賄われていた。著者は博士ロナルド ・ フェルプスのビデオでひなの銘柄選択基準の説明をありがちましょう。Ahmed Elaswad とカリム大同博士研究を資金調達のためワシントン DC のエジプト文化および教育局を感謝したいと思います。

この実験は、魚の遺伝学研究ユニット、e. w. シェル水産総合研究センター、オーバーン大学、アラバマで行われました。この実験で使用されるすべての実験的プロトコルは、実験が開始される前にオーバーン大学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC-AU) によって承認されました。この実験で使用される材料・機器リストは、材料表で見つけることが。以下に、手順と手続きの準備とアメリカナマズ 1 細胞期胚の図 1に示します。
1. くよくよ銘柄選定と産卵
<ol><li>ひずみまたは関心の遺伝的系統から健全なアメリカナマズひな株式を選択します。アメリカナマズの男性と女性は、良い二次性徴を表わすべきであります。</li>
	<li>よく発達した性器乳頭で自分の体の残りの部分よりも広い広い筋肉ヘッドを持っている男性を選択します。暗い色、瘢痕、領土戦いから傷は、性的な準備の兆候です。自分の体の残りの部分よりも狭く、頭を持って女性を選択し、ソフト、触知可能なバランスのとれた腹部があります。精度と初期処理中に魚を強調を避けるためには、産卵のための準備を検討する前に 2-3 日、女性を餌を停止します。</li>
	<li>魚が慎重に、迅速に処理を実行します。処理のストレスを減らすためには、産卵袋 (32 mm サイズ メッシュ) で魚を押しながら処理女性を必要とするすべての手順を実行します。</li>
	<li>排卵を誘発するホルモン注射の直前に、女性の体重を測定します。</li>
	<li>継続的な水の流れと十分なエアレーション タンクを通過する流れの中の女性と産卵の袋を掛けます。</li>
	<li>無菌、黄体形成ホルモン放出ホルモン アナログ (LHRHa) インプラントの 85 μ g/kg を 14 G 針は注入をロードします。0.9% 滅菌生理食塩注射前に、と注射部位 (背側の筋肉) をすすいでください。45 ° の角度で、注入装置を挿入し、インプラントをリリースします。70% エタノールに浸した綿球で針と注射部位にスワイプを撤回します。</li>
	<li>場所保有物タンクで産卵袋魚は水没、水水面下 15-20 cm。(上記 5 ppm の溶存酸素) 十分な通気と水質が良い高品質卵の排卵のため重要です。</li>
	<li>水の温度を35度時間 (h) の関係を使用してに基づいて排卵時間を予測します。度 h 応答時間ホルモン注射と排卵 (h) 時間を = * 水の温度 (° C)。たとえば、900-1,000 度 h 応答時間の女性目されているホルモン注入時 25 ° C から 36-40 h通常、卵の最初のチェックは、ホルモン投与後約 36 h、4 h の間隔で行われます。</li>
	<li>で排卵をチェックするには、産卵バッグ内側に取り付けられている卵を捜している間水面上産卵袋がフワリします。少なくとも 10 卵を見てこの女性は排卵と手除去のため準備ができていることを示します。</li>
</ol>2. 精子の準備
注: 精子予想される排卵時間前に少数の時間を準備することができます。
<ol><li>麻酔は、精子の運動に悪影響を及ぼすかもしれないので麻酔なしで、頭にパーカッシブな打撃によって男性を安楽死させます。</li>
	<li>小秤量皿に睾丸を収集、任意の組織を削除し、必要に応じて血液を削除する 0.9% 生理食塩水 50 mL で洗浄します。よく発達した精巣は白 villiform 突起が無数に (図 2) です。</li>
	<li>睾丸の重量を決定します。</li>
	<li>精子ソリューションを卵の受精の準備、精巣を鉗子を使用して 100 cm2 100 μ m メッシュのセンターに転送します。精巣精巣中にクラッシュを使用してメッシュを折るし、50 mL のコレクション チューブに精子をフィルターします。これは、親指を経由して、コレクション チューブの縁に対してメッシュ内の精巣に圧力を適用することによって行うことができます。0.9% 食塩を使用して、コレクションの管にメッシュから精子を洗浄します。食塩は、精巣の 10 mL/g まで追加できます。</li>
	<li>精子の濃度、運動性および生存率をチェックしてください。 注: 濃度は希釈容積の分かっている白子の診断で精子細胞をカウントすることによって決定できます。また、分光光度計を使用して白子の光学密度を評価することによって精子密度を推定できます。この方法では 505 nm の波長で吸収は以前精子36の異なる濃度の吸収のために準備されている管理図と比較されます。精子の運動は、精子運動 (運動期間と呼ばれる)37の停止まで精子の活性化からの時間として、顕微鏡下でチェックできます。実行可能な精子無染色まま実行可能なだけの精子細胞を染色トリパン ブルーなど選択的色素を持つ精子を染色して、精子の生存率を決定できます。ただし、マイクロインジェクション手順、これは精巣がよく発達している場合は必要はありません。</li>
	<li>4 ° C で 2.5 ステップから 0.9% 生理食塩水で精子を格納し、準備の後 24 時間以内に使用します。</li>
</ol>3. 卵のコレクションと受精
<ol><li>直径 20 cm のきれいな乾いたパンを産卵に短縮野菜の非常に薄い層を適用します。</li>
	<li>100 ppm の炭酸水素ナトリウムとバッファー tricaine メタン スルホン酸を含んだ麻酔液で女性の場所 (最終的な解決の pH は 7.0 であるべき) 魚は完全に麻酔38まで。 注意: Tricaine メタン スルホン酸刺激吸入、摂取または皮膚を通して吸収される場合があります。</li>
	<li>慎重に、産卵の袋から魚を削除し、麻酔液を洗浄する 0.9% 生理食塩水に浸し。魚は、魚の体表の粘液層の除去を避け、清潔なタオルを使用して完全にオフに乾燥します。</li>
	<li>植物性ショートニングを手剥離中に卵の付着を防ぐために、骨盤のフィンを含む口の周りの領域に適用されます。</li>
	<li>手は、卵巣に穏やかな圧力を適用することによって産卵フライパンに卵をストリップします。良い卵が自由に流れる、色、黄金の黄色、最小限を持ってない塊や血栓 (図 2)。水は珠孔閉鎖を刺激することができます卵と受精する前に水との接触を避けてください。</li>
	<li>マイクロインジェクションの卵を受精させると、200-300 卵を産卵フライパンに転送します。油を塗ったプラスチック植物のラベルは、産卵フライパンに卵を転送するスプーンとして使用できます。精子ソリューション (ステップ 2.5) から卵への 1-2 mL を加え、軽く混ぜます。卵に精子の比率は、約 11,000 精子・卵をする必要があります。</li>
	<li>精子と卵をアクティブに卵に淡水を追加します。少し卵をカバーするために十分な水を追加します。1-2 分で 30 s. 受精が発生するため、そっと卵を旋回します。単一の層で整理される卵を受精させることが重要です。ナマズ卵は、胚の複数の層を microinject が難しく、お互いに準拠します。</li>
	<li>受精卵より淡水を追加でき、10-15 分を強化する卵。</li>
	<li>乾燥を防ぐために、数時間にわたって受精濡れタオルで未受精卵の残りを含んでいる産卵鍋をカバーします。受精をずらして行うことができます、マイクロインジェクションと非注入コントロール胚の 1 つのセル段階の胚の連続供給を確保するため,の 200-300 の卵をすることができます 1 つのバッチが 30-60 分毎を受精するたとえば。卵がそれらを削除する困難にぬれたタオルに付着濡れタオルと卵との接触を避けてください。このプロトコルでは除去した後 2-3 時間以内の受精卵が効率的に microinjected し、いた卵同様の成功は、除去した後すぐに受精します。</li>
</ol>4. 針を引っ張ると読み込み
<ol><li>2 針 (図 3) に 1.0 mm 外径ホウケイ酸ガラスの毛細管を引き出します。いくつかの切開が行われているスポンジの切れ端で紙箱に針を格納します。針を破損しないよう、スポンジの直径が針の幹の長さよりも小さい必要があります。</li>
	<li>鋭いオブジェクトを使用して針の薄領域の小さい部分を分割することにより、針の先端を開きます。また、先端の薄領域を顕微鏡下で鉗子でつまんで針を開きます。</li>
	<li>Cas9 タンパク質と gRNA(s) を混ぜて注射液を準備します。他のタイプの RNA やタンパク質を注射して、同じ手順でこともできます。このプロトコルでは gRNAs はアメリカナマズ免疫関連遺伝子、フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子の 2 つをターゲットに設計されシャーらによると準備します。高品質な Taq ポリメラーゼ32,39を使って。GRNAs のゲノムのターゲットだった 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA TICAM 1 遺伝子 (図 4) 3' と 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' protospacer 隣接するモチーフ (PAM) RBL 遺伝子のエクソン 1 シーケンス下線 (図 6) のため。<ol>
<li>アメリカナマズ ゲノムに対して爆発ガイド RNA ターゲット シーケンスし、潜在的なターゲットを離れてサイトを持たないものを選択します。</li>
		<li>フェノールレッドをカラー gRNA/Cas9 蛋白質は総量の 3 分の 1 をミックスに追加します。</li>
		<li>それぞれの胚は 50 で注入されるヌクレアーゼ フリー水混ぜ gRNA/Cas9 タンパク質の最終濃度を調整 nL 約 2.5 ng gRNA と 7.5 ng Cas9 蛋白質を含みます。使用する前に氷で 10 分間混合物を孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microloader と針の幹に、microloader を挿入する microloader チップ (図 3) を後退しつつゆっくりと混合物を追放して注射針に gRNA/Cas9 混合物の 5-10 μ L をロードします。内部に気泡を引っかけないように。</li>
	<li>マイクロ ピペット ホルダー付ける針とタイトな接続を確保するマイクロマニピュレーターにホルダーを取り付けます。無料の安定した動きを確認します。窒素ボンベを開き、圧力レギュレータを調整するマイクロインジェクションの圧力を適用します。 注: 注入量は、圧力、ニードル絞りの直径および注入の期間によって影響を受けます。鉱物油のドロップに注入を注入するボリュームを決定するには、診断に配置。必要な場合、注入量を増減する圧力、射出と針直径の期間を調整できます。鉱物油は一貫性のあるボリュームを確保するために複数回を挿入します。</li>
</ol>5. ナマズ胚のマイクロインジェクション
<ol><li>植物性クリーン 100 mm ペトリ皿にショートニングの非常に薄い層を適用します。</li>
	<li>油を塗ったプラスチック植物のラベルを使用して、ペトリ皿に受精パンから 50-100 卵を転送し、Holtfreter のソリューション (材料表) とそれらをカバーします。単一のレイヤーにお互いに対して卵を合わせます。この配置は、マイクロインジェクション プロセス中に場所に卵を保持する必要があります。</li>
	<li>卵とペトリ皿を顕微鏡のステージに配置し、片方の手でそれを保持します。単一の滑らかな動きで絨毛膜や卵黄を貫くそれまでは、もう片方の手 (図 3) 針を下げ。針の先端は、注入材料を配信する前に、blastodisc にできるだけ近くする必要があります。<ol>
<li>卵黄に注入材料を提供するペダルを押し下げます。Blastodisc が明確に表示されていない場合は、卵黄内の異なる場所に注入材料を広げることができます。針を挿入し、卵黄の遠端にし、ペダルと針を撤回、卵黄の異なる領域を介して注入材料の普及に同時に行われています。50 nanoliters までに注入することアメリカナマズの卵黄の胚は、しかし、gRNA/Cas9 の蛋白質の量は各遺伝子突然変異率および胚の生存のための32の最良の結果を達成するために最適化する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スムーズに針を撤回、卵を損傷しないようにします。同じ手順で別の卵を注入するシャーレに移動します。これが卵を損傷したり、針を破ると注入プロセス中にペトリ皿の動きを避けてください。破裂またはマイクロインジェクションによる建物損傷の卵を削除します。注入受精後 15-20 分で開始することができますコンティニュ (受精後約 60-90 分) までまだ 1 つのセル段階で胚がいる限りは。</li>
	<li>ドキシサイクリンと40を孵化まで 6-7 日間連続の穏やかな通気が 10 ppm と Holtfreter のソリューションに戻って挿入された胚を配置します。ソリューションを毎日変更し、死胚を削除します。</li>
</ol>6. 突然変異の検出
<ol><li>ランダムに、72 h ポスト受精でいくつか挿入された胚を収集、卵黄を削除およびゲノム DNA を抽出します。コントロールとして 3-5 非注入胚が含まれます。 注: ゲノム DNA は、卵の殻と卵黄素材プロティナーゼ K 消化とエタノール沈殿物32を使用しての除去後胚から抽出することができます。</li>
	<li>ゲノムの各遺伝子は、突然変異が、忠実度の高い Taq ポリメラーゼ32を使用して予想されるの gRNA 対象を並ぶ DNA のセグメントを増幅します。TICAM 1、5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG プライマーの 3' (フォワード) と 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (リバース)、750 を増幅する使用された RBL、5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA プライマーの中 bp 3' (フォワード) と 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (反転) しました。RBL 遺伝子から 375 bp セグメントを増幅します。<ol>
<li>次の PCR の反作用を使用して: 最大 20 μ L PCR グレード水;1 x 高忠実度 MgCl2、0.2 mM dNTP Taq の酵素反応バッファーをミックス、それぞれ同じセット、100-300 ng の DNA と忠実度の高い Taq の酵素ブレンドの単位数として 1.25 の前方および逆のプライマーのための 0.4 μ M。PCR の循環状態を実行: 初期変性 94 ° c 3 分;35 サイクルの変性 94 ° C で 30 s、55 60 ° C で熱処理、TICAM の s と 40 の RBL、72 ° c 1 分/kb; 拡張用10 分のための 72 ° C で最終的な拡張子。</li>
	</ol>
</li>
	<li>精製 PCR の製品、測量変異検出アッセイ、ヘテロデュプレックス易動移動性試金、制限酵素認識部位の損失のシーケンスなどの変異検出法やが、他の変異検出法を用いた変異胚を検出します。ターゲットに適しています。このプロトコルでは、TICAM 1 と RBL 遺伝子の精製 PCR 産物の塩基配列決定と同様、 SapIカット サイト制限酵素の損失のため測量変異検出法を用いた突然変異体の胚を検出します。</li>
	<li>突然変異体の対立遺伝子を識別するために PCR の製品と個々 のコロニーからシーケンス ベクトルをクローンします。提示し、図 4と図 6突然変異体の対立遺伝子は挿入された胚から来た。6 からの PCR の製品の microinjected し、TICAM 1 と 8 を含むシーケンス、RBL 遺伝子の 48 のベクトルの 2 つの個別のチューブ、microinjected 胚の 1 つ、コントロールの胚は、急速に複製のための他と 86 ベクトルの各遺伝子の 3 コントロール胚を集めた各遺伝子の 3 コントロール非注入胚からの反応をシーケンスします。</li>
	<li>別の突然変異体の対立遺伝子を識別するために変異胚からブラストや T コーヒーなど DNA シーケンスの配置ツールを使用して野生型シーケンスのシーケンスを比較します。</li>
</ol>

著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

遺伝子ノックアウトを達成するためにチャネル ナマズ胚のための詳しいプロトコルが提示されました。卵黄の CRISPR/Cas9 蛋白質の注入ははるかに簡単、時間を節約、ほとんど遺伝子導入や遺伝子編集魚の一般的な手法である一の細胞胚の blastodisc を microinjecting と比較した場合の広範なトレーニングを必要としません。30,42。 現在のプロトコルはア?...

マイクロインジェクション、細胞または胚ガラス毛管1を DNA、RNA、タンパク質、および他の高分子などの物質の少量を提供するために使用一般的な検査手法です。インジェクションは、マイクロ、マイクロマニピュレーター、顕微鏡2など特別な機器セットアップを使用して実行されます。手法は、遺伝子を通じて世代遺伝子組み換え、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子療法の細胞内構成要素3,4のダイナミクスを理解することを目的とする生物の多くを変更するのには研究者によって使用されています,5。
アメリカナマズ (Ictalurus イシガキダイ) は養殖に最も人気のあるナマズの種とアメリカ合衆国の遊漁船活動。チャネル ナマズの機能ゲノミクスの研究がますます必要あり、アメリカナマズの完全なゲノムの配列ゲノム編集ツール6、7の最近の進歩の有用性を高めます。遺伝子機能の理解だけはナマズ、実施されている研究の充実がないが、ナマズ産業を強化するより効果的な遺伝的改良プログラムにも 。興味の特定の特性の重要な遺伝子を特定すると、遺伝的有利な対立遺伝子を生成するゲノム編集によるナマズ生産を転送する、有害な対立遺伝子を抑制すること、これらの対立遺伝子の選択を改善するために使用できます。遺伝子導入、またはこれらのオプションのいくつかの組み合わせを有利な対立遺伝子。1 つの魚の種から商業的に有益な特性の異なる最高の遺伝子を組み合わせることによって、生産性と収益性魚生産操作8を大幅向上させるでしょう。
遺伝子ノックアウトは、遺伝子機能の生体を研究する直接法です。DNA レベルでの突然変異は、さまざまな世代の効果の研究を容易にする将来の世代に継承されます。異なるゲノム編集ツール開発含む亜鉛指核酸 (ZFNs)、転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) して定期的に空間短い回文繰り返し/CRISPR 関連タンパク質 9 (CRISPR/Cas9 をクラスター化) システム9,10、11,12。
CRISPR/Cas9 システムから RNA 誘導部位特異的 DNA 胸の谷間5,13魚の遺伝子ノックアウトを含むゲノムの DNA 配列を編集する使用されている強力な効率的なツールです。システムは、ゲノム DNA エンドヌクレアーゼ酵素、Cas9 で対象のシーケンスを決定するガイド RNA (gRNA) で構成されます。ZFNs と TALENs 上のいくつかの利点とのゲノムの任意のシーケンスをターゲットに CRISPR/Cas9 システムを設計することができます: (1) 低コスト (2) 簡単に工学ガイド RNA ターゲット シーケンスに結合した (3) より特定化したターゲットを突然変異 (4)複数のシーケンスが変更されません TALENs とまでの変異の (6) の改善された生殖伝送速度 6-fold ZFNs と TALENs14と比較した場合の遺伝子の同じ時間 (5) 高い突然変異率の異なる gRNA の対象になることができます。 15,16,17,18。
マイクロインジェクションの主な方法として、エレクトロポレーション、電気衝動が胚又は細胞膜の透過性と生体分子19,20の吸収を高めるために適用されます。いくつかの遺伝子導入魚はメダカ (メダカ)、ゼブラフィッシュ (動脈分布)、マスノスケ (オンコルヒュンクス ・ tshawytscha)、アメリカナマズ、鯛 (Sparus sarba) などのエレクトロポレーションを使用して生成された、一般的な鯉 (コイ)21,22,23,24,25,26。
エレクトロポレーションは遺伝子ノックアウトのプラスミド Cas9 の DNA、RNA および蛋白質を提供する使用されています。哺乳類セルの Cas9/gRNA プラスミド DNA Cas9 mRNA/gRNA、および Cas9 タンパク質/gRNA 複合体は、エレクトロポレーションを使用して配信され、突然変異誘発率はほとんどエレクトロポレーション テスト条件27Cas9 蛋白質/gRNA 錯体を用いた最高だった。マボヤ脊索動物 (ユウレイボヤ)、TALENs の構造を表現する複数の遺伝子28のノックアウトを誘発する受精卵に electroporated だった。ZFNs プラスミドの構成要素表現されたアメリカナマズ29黄体形成ホルモンをノックアウトする electroporated。ただし、一度細胞に導入し、プラスミドの構造必要があります RNA に転写、RNA のマイクロインジェクションに比べて突然変異誘発の時間を遅らせる可能性が高い目的の DNA シーケンスをターゲットすることができます前に機能性タンパク質に変換/タンパク質。胚の開発は、遅延変異は注入された創設者のモザイクを増加します。さらに、遺伝子組換え発現はマイクロインジェクション、変異導入効率を下げることで発現レベルを達成する可能性はありません。
細胞にゲノム編集ツールを導入するための手段としてマイクロインジェクション エレクトロポレーションにいくつかの利点があります。ゲノムの分子の編集は、細胞または胚マイクロインジェクション30を確実に導入できます。以下の注入材料が必要です。注入される材料の量を決定するは簡単です。高い突然変異の創始者魚における低モザイクでレートすることができます達成 F1変異の生殖を改善するでしょう。創始者の少ない魚は高い突然変異率のための最初の世代を作り出すために分析される必要があります。エレクトロポレーションで創設者のより多くの魚は、コストが増加分析する必要。ただし、アメリカナマズ microinjected 胚の生存はより多くの胚31,32を注入することによってこれを克服するのに electroporated のものより低い。アメリカナマズ、16 〜 55%、対象遺伝子によって卵黄 microinjected 胚の生存、gRNA/Cas9 蛋白質32の投与量。
ナマズ胚の正規のインジェクションは技術的に難しく、時間がかかり、ただし、迅速かつ効率的な CRISPR/Cas9 蛋白質マイクロインジェクション プロトコルが表示チャネル ナマズ胚のため。このプロトコルでは、1 つの細胞胚の卵黄に CRISPR/Cas9 タンパク質溶液を注入するので以下の時間と専門知識が必要です。受精卵の数百は、1 h (約が発生する最初の細胞分裂に必要な時間) で注入することができます。プロトコルを検証するため、2 つ病感受性関連遺伝子はアメリカナマズ、フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプターの分子 (TICAM1) 遺伝子、ラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子のノックアウトされました。TICAM 1 は、toll 様受容体 (TLR) 3 によって開始されたシグナル伝達経路に関与しています。TICAM 1 チャネル ナマズのE. ictaluri33耐性種、青ナマズのダウンレギュ レートであった細菌愛媛 ictaluri課題、次亢進していた劇的に。RBL は、病菌 columnareカラムナリス病の病原の感染初期で重要な役割を果たしている、急性と堅牢なアップレギュレーションに比べてカラムナリス病感受性チャネル ナマズの緊張で記録された、カラムナリス病耐性株34。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

アメリカナマズ遺伝子機能を勉強する大きな機会につながる、アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイの完全なゲノムが配列されています。遺伝子ノックアウトは、これらの遺伝子機能の生体を研究に使用されています。クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは、遺伝子の機能を変更するゲノム DNA 配列を編集するための強力なツールです。従来のアプローチは、マイクロインジェクションによる単一細胞期胚に CRISPR/Cas9 mRNA を導入してきましたが、ナマズの遅く、非能率的なプロセスをすることができますこの。ここでは、CRISPR/Cas9 蛋白質とアメリカナマズ胚のための詳しいプロトコルを説明します。簡潔に、卵子と精子は、収集し、人工受精を実行をだった。受精卵は、Holtfreter のソリューションを含むペトリ皿に移されました。注入量が校正され、ガイド Rna/Cas9 ターゲット フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM 1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。オクターリピートされた DNA の配列によって確認された遺伝子ノックアウトに成功しました。これらの突然変異のための予測された蛋白質シーケンス変更フレーム シフトを含めるし、時期尚早停止コドンによる蛋白質を切り捨ています。

マイクロインジェクション プロトコルの効率を示すためには、gRNAs チャネル ナマズ フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子をターゲットに設計された microinjected。
TICAM 1 プール、クローンの PCR の製品からの個々 のコ?...

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 システムを用いたチャネル ナマズ胚の遺伝子を編集するための簡単かつ効率的なマイクロインジェクション プロトコルが表示されます。このプロトコルでは Rna、ガイドし、Cas9 蛋白質は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。このプロトコルは、2 つのチャネル ナマズ免疫関連遺伝子をノックアウトによって検証されています。

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

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QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

遺伝学

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...