呼吸測定システムの校正後、各チャンバーのMiR05を新しい2.1ミリリットルのMiR05溶液と交換します。呼吸器測定ソフトウェアで、機器の設定を入力します。ファイル名と保存設定を行います。
次のダイアログボックスで、各チャンバーに追加された各サンプルの重量など、サンプル情報を入力します。次に、酸素校正ウィンドウを開き、[ファイルからコピー]をクリックして、保存した空気校正ファイルを選択します。次に、 キャリブレーションしてクリップボードにコピー ボタン。
細い鉗子を使用して、マウスから以前に分離された筋線維束を慎重に呼吸溶液に移します。ストッパーをチャンバーに置き、ストッパーを底まで約半分押してチャンバーを半閉じます。ストッパーのOリングがチャンバーの壁にかみ合ったら、押し下げながらねじる動作で閉じます。
チャンバーが半分閉じられると、チャンバーの上部に小さな気泡が観察されます。10ミリリットルのプラスチック注射器に、酸素タンクからの純酸素を入れます。長くて鈍い針をシリンジに置き、最初のチャンバーに針を挿入して、約1ミリリットルの酸素をゆっくりと供給します。
チャンバーの酸素濃度を監視します。濃度が350〜400ナノモル/ミリリットルに達したら、ストッパーを押し下げながらゆっくりとひねり、チャンバーを完全に閉じます。チャンバーを観察し、気泡が残っていないことを確認します。
レイアウトメニューから酸素フラックスデータを組織の質量に正規化するには、レイアウト06の単位サンプルあたりの特定のフラックスレイアウトを選択します。酸素添加後に酸素濃度と酸素フラックスが安定していることを確認して、呼吸測定を開始します。10マイクロリットルのガラスシリンジを使用して、各チャンバーに2.5マイクロリットルの0.8モルリンゴ酸を追加します。
F4を押してタイムラインをマークし、マークにM.Record安定酸素フラックスのラベルを付けます。好気性解糖薬については、各チャンバーに10マイクロリットルの2モルグルタミン酸と5マイクロリットルの2モルピルビン酸を追加します。F4 キーを押してタイムラインをマークし、マークに GP のラベルを付けます。安定した酸素フラックスを1〜2分間記録します。
脂肪酸基質の各チャンバーに10マイクロリットルの2モルグルタミン酸と10マイクロリットルの10ミリモルパルミトイルカルニチンを追加します。.F4 キーを押してタイムラインをマークし、マークに GPC のラベルを付けます。安定した酸素フラックスを1〜2分間記録します。
25マイクロリットルのガラスシリンジを使用して、各チャンバーに20マイクロリットルの0.5モルADPを追加します。F4 キーを押してタイムラインをマークし、マークに ADP のラベルを付けます。安定した酸素フラックスを1〜2分間記録します。
次に、各チャンバーに20マイクロリットルの1モルコハク酸を追加します。F4を押してタイムラインをマークし、マークにS.Record安定酸素フラックスのラベルを1〜2分間付けます。10マイクロリットルのガラスシリンジを使用して、各チャンバーに4ミリモルシトクロムcの5マイクロリットルを追加します。
F4 キーを押してタイムラインをマークし、マークにシトクロム c のラベルを付けます。安定した酸素フラックスを1〜2分間記録します。10マイクロリットルのガラスシリンジを使用して、1ミリモルFCCPの3つの1マイクロリットルボーラスで滴定します。
FCCP版では、酸素フラックスレベルが一時的に減少します。酸素フラックスが増加して安定するのを待ってから、記録してください。F4を押してタイムラインをマークし、FCCPでマークを付けます。
安定した酸素フラックスを1〜2分間記録します。アッセイが完了したら、ストッパーを軽くひねって上に引っ張って取り外します。チャンバーを超純水で3回すすぎ、続いて70%エタノールで3回すすぎます。
抵抗が感じられるまでストッパーをチャンバーに入れますが、完全に閉じないでください。次に、ストッパーにキャップをします。アッセイファイルを保存し、装置をソフトウェアから切断します。
最後に、呼吸計の電源を切ります。適切に調製されたマウスサンプルでは、ADP後のシトクロムcの添加は酸素フラックスに影響を与えず、ミトコンドリア外膜の完全性が確認されました。しかし、組織サンプルが適切に調製されていなかった場合、ADP後にシトクロムcを添加すると、酸素フラックスが40%増加し、ミトコンドリア外膜が損傷したことが示されました。
