まず、6種類の線虫増殖培地またはNGM寒天プレートを調製します。翌日、200マイクロリットルの大腸菌OP50培養物をプレートに加え、室温で1日間インキュベートします。インキュベーション後、200マイクロリットルの0.025モルD-グルコースを4枚のNGM寒天プレートに加え、室温で乾燥させます。
Caenorhabditis elegans Bristol N2の異なる段階的な3〜4チャンクを、メンテナンスNGM寒天プレートから大腸菌OP50を装着した新しいNGMプレートに移します。C.elegansワームを摂氏20度、湿度95%以上で3日間インキュベートします。3日後、蒸留水をプレートに加え、パスツールピペットを使用してワームを収集します。
収集した線虫を50ミリリットルの遠心分離管に移し、重力によって沈殿させてから、チューブから上清を取り除きます。次に、蒸留水をチューブに加えます。チューブの容量が5ミリリットルに減少したら、漂白液10ミリリットルを追加し、チューブを約6分間激しく振とうします。
次に、M9バッファーを50ミリリットルの容量までチューブに充填し、1400gで3分間遠心分離します。上清を最大5ミリリットルまで除去し、45ミリリットルのM9バッファーをチューブに追加します。最後の洗浄後、上清を15ミリリットルまで取り除き、残りの液体をプレートに移します。
プレートを顕微鏡で観察して卵子の放出を確認し、プレートを摂氏20度、湿度95%以上で14時間置きます。インキュベーション後、ワームを15ミリリットルのチューブに集めます。自動ピペットを使用して、10マイクロリットルの同期ワームを顕微鏡スライドに加えます。
ワームの数を数え、マイクロリットルあたり500〜1000個のワームを取得するために必要な量を計算します。500〜1000匹の幼虫ステージ1(L1)を同期した線虫をNGM寒天プレートに移します。事前に調製し、大腸菌OP50とグルコースを播種しました。
ワームが幼虫のステージ4(L4)に到達するまで、プレートを摂氏20度でインキュベートします。48時間後、M9バッファーをプレートに加え、パスツールピペットを使用してL4幼虫を採取します。採取した幼虫を1.5ミリリットルのチューブに移します。3つの実験グループのアッセイスケジュールを設計します。
各グループから約100マイクロリットルのワーム懸濁液を、400マイクロリットルの5%ルゴールヨウ素溶液を含む1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。.ミキサーでチューブを5分間静かに攪拌します。ミキサーからチューブを取り外した後、ワームが重力によって沈殿するのを待ちます。
1ミリリットルのM9バッファーでワームを3回洗浄します。100マイクロリットルのM9バッファーにワームを再懸濁した後。約50マイクロリットルをスライドに移します。
カバースリップをスライドに置きます。次に、実体顕微鏡で明視野モードを選択し、線虫を観察します。グループごとに最低 10 個のワームを含む画像を jpeg ファイルとして保存します。
最後に、線虫のヨウ素染色に基づいてグリコーゲン含有量を計算します。グリコーゲン含量アッセイの目視観察により、空腹時線虫は、大腸菌OP50を給餌した線虫や、大腸菌OP50とD-グルコースを給餌した線虫と比較して、染色が弱かったことが明らかになりました。
