Name: plate-based large-scale cultivation of caenorhabditis elegans: sample preparation for the study of metabolic alterations in diabetes
Uploaded: 2018-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
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本研究は、ドイツ研究振興協会 (DFG) IRTG 1874「糖尿病性血管合併症」と CRC 1118「糖尿病合併症の原因として反応性代謝物」によって支持されました。線虫株 N2 と CL2166 は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。

注: このプロトコルは、5 つのセクションに分かれています。セクション 1-3 大規模な線虫を培養する主なプロトコルが表示されます。セクション 4 と 5 は、糖尿病代謝で発生する例示代謝物の評価の追加のプロトコルを提供します。詳しくは、セクション 1 は板の一般的な大規模な文化について説明します。セクション 2 はc. の elegansの大量の転送に焦点を当てて説明 3 は、大規模なサンプルの収穫に対し。セクション 4 のサンプルの蛋白質の隔離およびセクション 5 以降の液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (MS/LCMS) 分析のための試料の前処理をについて説明します。
1. 大量培養プレート上
<ol><li>一般に、機能無菌フードの下にまたは汚染を避けるために開いた炎の横にあります。</li>
	<li>
文化にワーム若い大人の段階に達するまで次の適応を持つこの以前に発行された議定書7に従ってください。
	<ol>
<li>生菌大腸菌OP50 を使用して線虫をフィードし、実験のため 400 μ M フルオロデオキシウリジン寒天 (アンピシリン/FUdR ではない) を準備します。</li>
		<li>同期の人口の準備、未濃縮 OP50 を使用し、大人の実験が成功、上澄みの 70% を除去することによって集中 OP50 x 3.3 を使用します。</li>
		<li>毎日の給餌間隔をお勧めします。酸化ストレスの評価、さまざまな間隔と授乳のためボリュームが結果と競合します。</li>
		<li>接種、いくつか線虫とプレートを取り、メスで約 0.5 x 1 cm2の断片に切断します。未濃縮 OP50 を含む、直径 60 mm の線虫成長メディア (NGM) プレートの上に 2、3 個セットを転送します。</li>
		<li>ひずみ (野生型 N2 は 20 ° C で培養する必要があります) に適した温度で版を孵化させなさい卵が皿の上に表示されるまで。</li>
		<li>M9 バッファーの 2 mL で卵と大人の動物のほとんどを洗って 15 mL チューブでそれらを収集します。2 分間 800 x gの懸濁液を遠心します。一方、漂白液の準備を開始します。</li>
		<li>遠心管を取り出すし、10 mL のピペットを使い、M9 バッファーを削除します。大人の線虫を分離まで渦の漂白のソリューションとミックスの 10 mL を追加します。これは通常約 5-7 分がかかりますが、15 分よりも長くしてはならない、または卵は実験後に完全に開発することはしません。</li>
		<li>800 x gで 2 分間洗浄ソリューションを漂白から卵をクリアする 10 mL M9 バッファーで 3 回の懸濁液を遠心します。</li>
		<li>今 OP50 プレートに卵の懸濁液の 150 μ L を追加します。200-300 卵の密度は各プレート上に達します。線虫大人の段階に達するまで待機します。 注: 描かれた実験用 M9 バッファー (pH 7.0) 以下の物質で構成されています: 22 ミリメートル KH2PO4、42 mM ナ2HPO4、および 86 mM の NaCl。オートクレーブ混合物後、1 mM MgSO4 を追加します。漂白液には 0.5 M NaOH、2.3 mM NaOCl を蒸留水で解決が含まれます。</li>
		<li>ワーム、およびそれらを収集するために 15 mL チューブを洗浄するカットと滅菌ピペット チップ先端不稔の M9 バッファーを準備します。</li>
		<li>プレートに約 1 mL の M9 バッファーを適用、プレートから線虫を振るとゆっくりピペットでバッファーを優しく配布。</li>
		<li>今、管内線虫を収集します。カット ピペット チップで (OP50 でシード) プレートに直接サスペンションの 150 μ L を適用し、線虫の密度を病理組織学的評価 (推奨: 60 mm プレートごとの 50-100 線虫)。</li>
		<li>密度が高すぎる場合は、目的の密度に達するまで顕微鏡で評価して M9 バッファーと懸濁液を希釈します。収量が少なすぎる場合、落ち着くか、遠心分離機の流体を削除する 800 x gで懸濁液 10 のワームをしましょう。 注: 十分な密度の例は、図 1 a (マクロスコ ピック) と 20 X 増強で (微視的) 1 bで与えられます。実証的に従って進んでください。</li>
		<li>ワームがすぐに落ち着くことを覚えてをおいてください。プレート間の等しい配分を確保するため、すべてのスタック プレート (4-5 版) の後チューブを反転します。 注: カット ピペットのチップとして穏やかな揺れと剪断応力を低減プレートの洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2。転送の大量の線虫
<ol><li>年齢や板の乾燥によって、M9 はバッファーの約 500 μ L で線虫を洗浄します。同じバッファーを使用して、動物のほとんどが懸濁液で収集されるまで、線虫をデタッチを繰り返します。</li>
	<li>ゆっくりカット ピペット チップで線虫を取るし、OP50 でプレートに転送します。ドライ プレートができます。 注: 推奨される量よりはるかに多くを適用するないように気をつけてください。特に長期的な実験は、プレートがそれを許さない、亀裂にクロールする線虫をできるように、寒天が破ることができます。</li>
</ol>3. 収穫大の線虫サンプル
<ol><li>選択した方法によってはc. の elegansの十分な量の実験を始めます。クロマトグラフィー-タンデム質量分析のサンプルあたり蛋白質の少なくとも 200 μ g の収量を確保するためプレートごと約 100 線虫を持つグループあたり 20 プレート (60 mm × 15 mm) を準備します。 注: プロトコルのこの部分は、線虫が収集され凍結としてはもう、無菌条件下で動作を必要ありません。</li>
	<li>サンプル コレクションの日に収集されたサンプルのスナップ-凍結液体窒素を準備します。マツ材線虫病の代謝を遅く氷の上の非滅菌の M9 バッファーを保持します。</li>
	<li>1 mL の M9 バッファーを適用しプレートを軽く旋回プレートから線虫を洗浄します。ある場合、現在細菌や寒天を守るため故人線虫とほとんどの卵の収集を回避できます。</li>
	<li>ボリュームを取るし、15 の mL の管にそれを転送します。</li>
	<li>完全なサンプルのコレクションの後、解決または 800 x gで簡単にチューブを遠心し、M9 バッファーの大部分を除去する線虫を待ちます。サンプル 3 を洗って約 10 ml の M9 の x (サンプル ボリューム x 10) 細菌を除去します。 注: すべての故人線虫が削除されていることを確認するには、ショ糖浮遊は別オプションです。ただし、これは表示されている実験15不向きでした。ショ糖はブドウ糖と果糖に加水分解します。描かれた実験でグルコースの役割は、持病の糖尿病の生化学的変化を促進するために評価されました。したがって、ショ糖浮遊可能性のある結果を混同できます。</li>
	<li>すべてのサンプルの 1 mL の M9 バッファーと 1 つの 1.5 mL チューブと 1 つの空の 1.5 mL チューブを準備します。空の 1.5 mL のチューブに 15 mL チューブからガラス ピペットを使い、ペレットを転送します。この手順は、定量的な伝達を確保することが重要です。 注: とは異なり、以前のステップの間にここで線虫より集中しています。プラスチック ピペット先端への可能な付着、によりサンプルの大きい部分の損失が予想されます。したがって、ガラス ピペットを代わりに使用します。</li>
	<li>転送後、ピペットの壁から線虫をリンスに 1 mL の 2 番目の 1.5 mL のチューブから M9 バッファーを取るガラス ピペットを使用します。また、15 mL チューブから残りの線虫を洗って、サンプル チューブに転送します。</li>
	<li>19,000 × gで 1 分でサンプル チューブを遠心分離機、可能な限りの上澄みを取り外します。</li>
	<li>パラフィルムでチューブをシールとすぐに液体窒素でスナップ-凍結するそれ。ライセート作製まで-80 ° c チューブを格納します。</li>
</ol>4. 質量分析のため蛋白質の隔離
注: ここで説明した蛋白質の隔離を (例えば、西部のしみ) 他のアッセイに使用もできます。
<ol><li>凍結サンプル 0.5 mm ジルコニア ビーズ、少なくとも 2 倍のプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む溶解バッファーのボリュームの同じボリュームを追加します。 注: 描かれている線虫蛋白質に相関分析を行ったバッファーの 100 μ L を使用します。LC ・ MS/MS サンプル バッファーの 200 μ L に溶解し。</li>
	<li>9 の速度で 1 分間ホモジナイザーを開始します。サンプルが完全に分離することを確認します。彼らは完全に分離していない場合は、この手順を繰り返します。</li>
	<li>19,000 x gで 4 ° C で 30 分間試料を遠心します。氷の上清を新しいチューブに転送、測定をとるつもりがさらにまで-80 ° C で保存できます。 注: 描かれた実験用非変性バッファーは以下の物質で構成されています: 20 mM トリス塩酸 (pH 8)、137 mM NaCl、1% トリトン X、2 ミリメートルの EDTA。 注: は、このプロトコルの推奨スケールを適用した手順に従ったこと、約 1,000 の線虫から蛋白ペレットの収量は約 500 μ g をする必要があります。多くの比較図 2および代表の結果を参照してください。</li>
</ol>5. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法による測定の前処理
注: 興味のパラメーターに応じて、サンプル準備が異なります。このプロトコルは、メチルグリオキサールや年齢の決定に焦点を当てください。
<ol><li>
上記9として 1, 2-diaminobenzene (DB) 誘導体化による細胞内メチルグリオキサールを測定します。
	<ol>
<li>冷たい 20% (重量/巻) トリクロロ酸塩化ナトリウム 0.9% (重量/巻) の 20 μ L と 1.5 mL チューブの水の 80 μ L 試料をホモジナイズしてください。</li>
		<li>スパイク内部標準の 5 μ L のサンプル (13C3MG; 400 nM)、ボルテックス、それらをミックスし、4 ° C で 5 分間 21,000 × gで遠心分離</li>
		<li>上澄みの 35 μ L を高速液体クロマトグラフィーのサンプルのバイアル 200 μ L ガラス挿入に転送します。</li>
		<li>0.5 mM DB 200 mM HCl 含む 0.5 mM ジエチレントリアミン酸 (DETAPAC) の水の 10 μ L の順に各サンプルに 3% アジ化ナトリウム (wt/巻) の 5 μ L を追加します。</li>
		<li>光から保護部屋の温度で 4 時間サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>上記9LC-MS/MS による試料を分析します。 注: 年齢の測定プロトコルのセクション 4 で説明したよう、蛋白質を分離します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ブラッドフォードの試金10を使用して (解凍) 溶解液のタンパク質濃度を測定します。
	<ol>
<li>ウシ血清アルブミン (BSA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 以下の濃度の解決とスパイク標準曲線の 30 μ L の因数を準備: 0;0.1 となります。0.2;0.3;0.4;0.6;0.8;1.0 Mg/dl。 注: 推奨されるサイズ サンプル調製した場合 (バッファーの 200 μ L でライセートの調製手順 4.1 を参照)、推定濃度は、およそ 2 – 7 mg/mL の範囲でする必要があります。この場合、希釈、サンプル 1:10 PBS で、測定前にします。 注: このメソッドを使用して最初の実験は勧め異なる希釈率のサンプルを測定する (1、1:10 と 1: 100)。線虫の数の厳密な決定は、個々 の研究者間収量できます異なります。</li>
		<li>透明の 96 ウェル プレート (ポリスチレン) を使用して、各標準濃度と井戸に重複で選ばれた希釈サンプルの 10 μ L をピペットします。</li>
		<li>希釈、タンパク質アッセイ色素試薬の集中 1:5 蒸留水 (aq。dest)希釈の 200 μ L をプレート上のすべてのサンプルに追加します。板室温で 10 分間、インキュベートします。</li>
		<li>595 で 30 分以内で吸光度を測定プレート リーダーの nm。サンプルは、計算された標準曲線から補間することができます。メソッドの詳細については、文献10に広く記載されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
前述11,12として細胞年齢を測定します。
	<ol>
<li>総蛋白抽出物 (約 200 μ g) を洗う遠心遠心ろ過単位 10 kDa によって水で 3 倍。</li>
		<li>回復されたタンパク質 (約 100 μ L) を 10 μ L の 100 mM 塩酸、ペプシン (20 mM 塩酸で 2 mg/mL) の 10 μ L、チモール (2 mg/mL で 20 mM HCl) の 10 μ L を追加し、37 ° C 24 時間でサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>中和し、ph 7.4 0.5 M カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) の 12.5 μ L を追加することによって、サンプルをバッファーと 260 mM コの 5 μ L。</li>
		<li>プロナーゼ E [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L を追加し、ペニシリン ・ ストレプトマイシン液の 10 μ L 24 h 37 ° C でサンプルをインキュベートし、。</li>
		<li>アミノペプチダーゼ [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L を追加し、プロリダーゼ [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L 48 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートし、。</li>
		<li>上記12- MS LC/MS による、結果として得られる加水分解物を分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fronius, M., Clauss, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-sensitivity+of+ENaC:+may+the+(shear)+force+be+with+you.">Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sohn, E. 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このプロトコルは、定量的な結果を得るためのc. の elegansの大規模養殖のための信頼性の高い方法を示します。文献からの知見は、代表の結果に示すように、レプリケート可能性があります。にもかかわらず、 c. の elegansの大規模なサンプルのコレクションのこのプロトコルはストレート フォワード法のように思える、考慮する点があります。線虫密度の同期に関?...

西部のしみや質量分析法などのタンパク質解析タンパク質のミリグラムが必要です。この収量の線虫、洗濯によって液体培養または線虫を転送する固体メディア上を達成することができます何百もの大規模な養殖が必要です。流体とせん断応力は、ナトリウム、線虫の寿命を変えることと代謝解析1 に影響を与える可能性があるの増加の取り込みによる浸透圧ストレスを高めることができる上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) の発現を誘導します。.したがって、プレート ベースのアプローチのこのプロトコルのいくつかの重要なステップは、アカウントに実験的変動に影響を与えるストレスの軽減を取る。液体培養は、他の一方で、線虫の表現型に影響を与えるし、文化と線虫2の正確な数のコレクションが複雑になります。さらに、反応生成物は、メディア コンポーネントによって変更することができ、線虫に達する前に均等に分散可能性があります。液体文化の制限については、このプロトコルはc. の elegansの大規模なサンプルを培養する方法を提供します。
線虫は 302 の神経細胞の異なるネットワークのモデル生物すべてのセル3の 3 分の 1 を構成します。多くの相同科学への導入以来オーソログ遺伝子の説明、医学研究のためのモデルとしてその値を増幅されています。最近では、糖尿病性網膜症、血管の損傷の前の神経学的な減損の証拠は4を提示されています。線虫は血管が欠けているが、血管のものから離れて神経の変化を調査するための適切なモデルを作るそれ異なる神経ネットワークが含まれています。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。糖尿病合併症の生化学的変化は、さらに高血糖5に応えて ROS の生成に及ぼす年齢の形成を含みます。年齢は線虫で発見され、神経損傷6に貢献。慢性疾患は、糖尿病合併症の評価をここで例示としてしばしば、メカニズムの評価のための多重アプローチを必要とする複雑なポリジーンのプロセスによって引き起こされます。このプロトコルは、だけでなく、その後複数のパラメーターを同時に、取得のための使用することができます。増加の比較と多重手法の再現性は、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで実現できます。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans &lt;/em&gt;N2</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans &lt;/em&gt;CL2166</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, 60 mm x 15 mm</td><td>Greiner One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>Volumetric pipet, glas, 10 mL</td><td>Neolab</td><td>E-0413</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>04693124001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;u&gt;Non-denaturing lysate buffer:&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodiumchloride (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, transparent bottom</td><td>Brand</td><td>781611</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200, plate reader</td><td>Tecan</td><td>30017581</td><td></td></tr><tr><td>Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm</td><td>Next advance</td><td>ZROB05-RNA</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender, homogenizer</td><td>Next advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Thymol</td><td>Sigma</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E/ Protease from &lt;em&gt;Streptomyces griseus &lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma</td><td>P43339</td><td></td></tr><tr><td>Prolidase from Porcine Kidney</td><td>Sigma</td><td>P6675</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidase from&lt;em&gt; Aeromonas proteolytica&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>A8200</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Basic Materials for plate culture are described in Reference &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;6&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

plate-based large-scale cultivation of caenorhabditis elegans: sample preparation for the study of metabolic alterations in diabetes

線虫(C. elegans) を寒天に大規模な方法で養殖は時間がかかり、困難にすることができます。このプロトコルでは、西部のしみ、質量分析法、またはさらにプロテオミクス解析を続行する蛋白質の分離のための動物の大規模な番号を取得する簡単で安価な方法について説明します。さらに、immunostainings の線虫の数の増加と同じ培養条件下で複数の解析の統合容易に達成します。さらに、異なる実験条件とプレート間の移動が促進されます。平板培養における一般的な技法白金線を使用して 1 つのc. の elegansの転送と住まれた寒天の転送チャンク メスします。ただし、線虫数増加に伴い、これらの技術に過度に時間がかかる。このプロトコルはc. の elegans多数の手順を含むワームの生理学的試料の影響を最小限に抑えるための大規模な文化をについて説明します。流体および剪断応力の寿命や線虫、こうして信頼性と再現性のある結果を取得するために重要な手順の詳細な説明を必要とする代謝過程を変更できます。線虫は最大 1/3 の神経細胞から成るが血管に欠けている、従って神経変化のみ血管制御の独立を検討する可能性を提供するモデル生物であります。最近では、早期の神経変性糖尿病網膜症は血管病変の前に発見されました。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。たとえばの高められた形成高度糖化最終製品 (年齢)、線虫に見られる再現性をもって、活性酸素種 (ROS) を観察しました。調査のより広いスペクトルのための適切なサイズのサンプルを処理するプロトコルは、糖尿病による生化学的変化の研究に代表されるここで、掲載されています。一般に、このプロトコルは大規模な線虫を必要とする研究に有用することができます番号とどの液体培養は適していません。

ここで大規模な線虫の作成例文化の糖尿病研究のアプリケーションに渡されます。総蛋白濃度を正常化するのではなく、パラメーターを 1 つの動物に関連する関心のことです。線虫の数が少ないを必要とする試金、これ簡単に達成できます、線虫をカウントすることによって。大規模な線虫の実験グループごと線虫の数百人を文化、この方法は便利です?...

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Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

このプロトコルは固体媒体で線虫の大規模栽培の方法をについて説明します。液体培養する代わりに、このプロトコルは、栽培プレート ベースの異なるスケールのパラメーターを取得できます。これは、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで結果の比較可能性を向上します。

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

plate-based-large-scale-cultivation-caenorhabditis-elegans-sample

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

6.3K ビュー.  Heidelberg University. このプロトコルは固体媒体で線虫の大規模栽培の方法をについて説明します。液体培養する代わりに、このプロトコルは、栽培プレート ベースの異なるスケールのパラメーターを取得できます。これは、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで結果の比較可能性を向上します。

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

遺伝学

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

神経科学

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

免疫・感染学

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

生物学

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

培養<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em &gt;微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

の栽培<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;ラボにおける三次元で

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離 されたカエノラブディティスエレガンスの 長期培養とモニタリング

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

線虫の大規模栽培のプレート・ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

要約

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この動画の章

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

大規模混合ステージカエノハブディティス・エレガンス集団の文化とアッセイ

A

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

基本的な

培養胚のための方法

培養

の栽培

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々のカエノラブディティスエレガンスの長期培養

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離されたカエノラブディティスエレガンスの長期培養とモニタリング

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

要約

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線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

A

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

基本的な

培養胚のための方法

培養

の栽培

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離 されたカエノラブディティスエレガンスの 長期培養とモニタリング

線虫の大規模栽培のプレート・ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

大規模混合ステージカエノハブディティス・エレガンス集団の文化とアッセイ

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々のカエノラブディティスエレガンスの長期培養

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離されたカエノラブディティスエレガンスの長期培養とモニタリング