スマーフ染色を用いた 線虫Caenorhabditis elegans の腸透過性の評価

まず、500〜1, 000 L1ステージの同期線虫Caenorhabditis elegansワームをNGM寒天プレートに移し、テストの日まで摂氏20度でインキュベートします。2 つの実験グループのアッセイスケジュールを設計します。M9バッファーを使用して、L4ワームと成虫をそれぞれの日に収集します。

採取したワームを1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、重力によってワームが沈殿するのを待ちます。1ミリリットルのM9バッファーでワームを3回洗浄し、最後の洗浄後にチューブに約500マイクロリットルを残します。自動ピペットを使用して、10マイクロリットルのウォーム懸濁液を顕微鏡スライドに追加し、マイクロリットルあたり100個のウォームを得るのに必要な容量を計算します。

新しいマイクロチューブに、100匹の線虫と100マイクロリットルの25%エリオグラウシン二ナトリウム塩溶液に必要な容量を追加します。次に、200マイクロリットルの大腸菌OP50培養物を追加し、M9バッファーを使用して容量を500マイクロリットルに増やします。ミキサーで攪拌しながらチューブを3時間インキュベートし、光から保護します。

インキュベーション後、線虫を重力で沈殿させてから、染色液が完全に除去されるまで1ミリリットルのM9バッファーで洗浄します。最後の洗浄後、ワームを250マイクロリットルのM9バッファーに再懸濁し、約50マイクロリットルをスライドに移します。カバースリップを置き、スライドを摂氏20度で10分間インキュベートして、ワームを麻痺させます。

実体顕微鏡を使用して、明視野モードで、ワームの総数と染色されたワームの総数をカウントします。腸管透過性アッセイでは、若い線虫に強い腸バリアが示され、色素の漏れが防止されました。対照的に、高齢の線虫は全身に色素の血管外漏出を示し、腸管の損傷を示しています。