間接的な免疫蛍光はDNA修復タンパク質、空間的および時間的なリクルートの写真を検出することを可能にし、DNA損傷の部位でタンパク質相互作用を尋問するのに役立ちます。DNA損傷後、DNA修復タンパク質は、その濃度が局所的に増加する間、DNA侮辱に採用され、固定サンプル上の間接的な免疫蛍光によって視覚化することができる病巣と呼ばれるグループを形成する。この技術は、タンパク質病巣を検出するだけでなく、細胞内の存在の共局在を定量するために使用することができる。
これは、複雑な形成とDNA修復に必要なイベントのシーケンスを説明するのに役立ちます。タンパク質相互作用は、このような実験から特定のタンパク質相互作用を伴うことができます。手順を実証するバーバラ・デ・ラ・ペナ、私の研究室からの非常に才能のあるポスドク写真は、18ミリメートルの丸いガラスカバースリップを80%の合流に12ウェルプレート上の各ウェルで40,000個のHeLa細胞を成長させることによって始まります。
細胞を4回の灰色ガンマ照射にさらした後、1ミリリットルのPBSで2回洗浄する。その後、PBSを完全に取り除き、各井戸に200マイクロリットルのNDBを加えます。室温で2分間細胞をインキュベートし、NDBを取り除きます。
インキュベーション時間は細胞株によって異なる場合がありますが、一般的には2分を超えないようにしてください。PBSの1ミリリットルで細胞を洗います。その後、PBSを完全に取り除き、細胞固定のために各ウェルに4%PFAの200マイクロリットルを加えます。
細胞を摂氏4度で10分間インキュベートします。その後、PFAを取り出し、各井戸にPBSの1ミリリットルを追加します。PBSを完全に取り出し、各ウェルに200マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、室温で2時間、摂氏4度で16〜18時間培養します。
一次抗体と希釈バッファーを希釈し、それを湿度ボックスでよく混合するまで、ここでパラフィルムの一部を、1回のドロップで一次抗体の 10 マイクロリットルを追加します。ウェルからカバースリップの1つの端をドロップに合わせ、ゆっくりと液体を広げるパラフィルムに下げます。カバースリップを室温で2時間インキュベートする。
インキュベーション後、PBSで3回、1回の洗浄でカバースリップを洗浄します。二次抗体と希釈バッファーを希釈し、よく混合するまでそれを、前に述べたように各カバースリップに10マイクロリットルの二次抗体を適用し、光から保護された室温で2時間インキュベートします。カバースリップをPBSで3回、水で1回洗浄します。
次に、透明なマニキュアでDAPIシールカバースリップを含むグリセロールベースの取り付けメディアでガラススライドに取り付け、20分間乾燥させます。60 x対物レンズに浸漬油を一滴入れ、DAPIを使用してXYZ画像取得用の接眼レンズを介して核を見つけ、取得ソフトウェアを開き、スキャナタイプをラウンドトリップとして、512 x 512の画像サイズとしてスキャナータイプをガルバノとして設定します。PMT パネルでは、モードを VBM 平均にフレームに設定し、シーケンシャルスキャンを行います。
次に、色素と熱検出器を設定してチャンネル1をDAPIとSD1に、チャンネル2をAlexafluor 488とHSD 3に、チャンネル3を647でアレクサフルーターに、HSDは4つを選択してライブ画像を調整Z.To、ライブウィンドウのライブボタンを押してフォーカスを調整します。次に PMT ツール ウィンドウを使用してレーザー強度の感度、ゲインとオフセット z スタックの場合は、[開始終了] と [15 スライス] を選択します。画像を保存するフォルダを選択し、LSMスタートボタンを押して取得を開始します。
終了したら、シリーズ完了ボタンを押して画像取得を完了します。解析ソフトウェアを開き、バッチツールウィンドウを押して、分析する画像を選択します。解析ツールウィンドウに移動し、15 スライスの最大強度投影を表示する投影を選択します。
入力出力設定で、作成されたバッチおよび出力フォルダを選択します。処理する画像を処理し、TIFFファイルとしてエクスポートするプロセスを押します。原稿の指示に従って細胞プロファイラーで核定量を行う。
放射線で処理されない細胞はガンマH2AXエキスポサインを非常に少なく示す。必須のDNA修復タンパク質がない場合、ガンマH2AX蓄積はDNA破断時に観察することができる。未修復の破断の蓄積は、固体ガンマH2AX核によって示される予後低血圧になる細胞を導くことができる。
照射後、核はガンマH2AX局地化が非常に急速に行われる多くの二本鎖破断を示す。放射線の不在時に病巣が観察される場合はほとんどないが、放射線後の1回の2つの4時間と16時間で病巣の数を定量化し、NOA放射線制御を行った。生物学的な問題と必要なデータの種類に応じて、異なるプロットオプションは、異なる動物種で提起された一次抗体を多重化し、二次抗体を使用して、異なる蛍光色素で標識することによって、共局在化を検討することができると考えるべきです。
緑と赤の重ね合わせは、黄色のホットスポットを生じさせ、対象となる2つのタンパク質が同じ画素に存在する。共局在化の定量分析は、オブジェクトベースのアプローチまたは強度相関係数ベースの分析を行う統計的アプローチによって達成することができる。異なる動物種で上げられた一次抗体の組み合わせは、このプロトコルで使用することができる。
抗体が互換性があり、相互に干渉しないことを確認してください。一次抗体ごとに使用する二次抗体を適切に設定し、使用する力を少なく選択する際には、特定のスペクトル重複を考慮する必要があります。共局化またはタンパク質は、可能な直接相互作用を示す。
これは、細胞内で粒状沈殿によって、またはインビトロで精製されたタンパク質を使用して直接置くことによって検証することができる。
