This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

注：実験動物からの組織が関与する次の手順では、動物の2013年の安楽死のためにAVMAガイドラインと一致しているとミシガン州立大学IACUCによって事前に承認された。 1.組織調製<ol><li>酸素または物理的障壁をイソフルランとの直接接触から動物を防ぐことを確実にする、室の床に吸収材料上に液体イソフルラン3~5 mlで配置することにより、2.5％のイソフルランを含むチャンバの研究動物を麻酔。フットパッドをつまんで麻酔深度のためのテスト。 NOTE：後肢の引っ込め反射が存在しない場合、麻酔の深さが適切であると考えている。適切に麻酔をかけた後、頚椎脱臼によりマウスを安楽死させる</li><li>仰臥位で動物を置き、70％エタノールで腹部の皮膚をきれいに。正中線で腹部の皮膚を挟ま6センチのメディアを作るために外科用ハサミを使用するように鉗子を使用して、内部消化器官を露出する白線に沿ってL切開。 </li><li>腹膜内部の回腸を見つけて、公開する鈍鉗子を使用してください。ハサミで回腸/結腸腸間膜をカットし、腸の解明始める。 </li><li>腸の長さが十分に解明された後、回腸の準備のために盲腸に胃と近位に腸遠位をカット。大腸の準備のために、直腸に盲腸と近位結腸遠位をカット。 </li><li>すぐに腸のセグメントを削除し、氷上で3μMニカルジピン塩酸塩及び1μMスコポラミン、塩酸を添加したDMEM / F12培地（以下、「メディア」という。）とのビーカーに入れてください。これらの阻害剤の添加は、消化管平滑筋を麻痺させることにより、顕微解剖とその後のイメージングを容易にします。 </li><li>確立された解剖学的マーカーに基づいて関心の切断セグメント（ 例えば 、空腸、回腸、遠位または近位結腸）。通常utiliz回腸遠位部または遠位結腸からの電子組織。しかし、すべての腸の地域で、負荷や画像筋層間神経細胞とグリアを分離するために同じ基本的な手順を使用します。 </li><li>チルド媒体で充填シルガードコーティングしたペトリ皿に希望腸セグメントと場所の小さなセグメント（4-6 cm）を取り外します。 </li><li>近位および昆虫ピンと腸のセグメントの遠位端部を固定し、縦に腸間膜の国境に沿って切断し、まっすぐにすることによって、腸の管を開きます。 </li><li>細かい鉗子（＃5、＃最高の45分の5作品）と、非常に微細な春のはさみを使用して粘膜層を離れて解剖まで、慎重に粘膜側と光張力下でフラットピン組織。 注：適切に行われていない場合は、粘膜の除去は、ENSのための非常に外傷性であることができます。品質の準備のために、剥離やこすることによって粘膜の突然の除去を制限するように注意してください。ベストプラクティスは、粘膜を持ち上げ、細かいハサミで下にカットすることです。 </li><li>小さい準備に組織を切断Sイメージング皿に（約0.5cm 2）とピン新鮮なメディアとの氷上に置かれ（円形筋層が上を向くようにして4隅）。 </li><li>慎重に筋層間神経叢を露出するように細かいピンセットで離れてからかうことで円形の筋肉を離れて解剖。過度のストレッチは避けてください。 </li><li>新鮮な培地と氷と変更ソリューションに戻ってイメージングディッシュを置きます。 </li><li> [メディアにディスパーゼ1 U / mlの（4.48ミリグラム/ 8ミリリットル）、コラゲナーゼタイプII 150 U / mlの（5.45ミリグラム/ 8ミリリットル）]皿当たり酵素ミックスの2ミリリットルを準備します。 </li><li>氷から皿を取り出し、ステップ1.13から酵素ミックスを追加します。 </li><li> 5％CO 2/95％空気で15分間、室温で皿をインキュベートする。 </li><li>メディア3回と再ピンの角を持つウォッシュ組織標本。 </li></ol> 2.のロードのFluo-4色素注：指示色素を搭載した蛍光色素および組織の処理中に制限された光と協力して光退色を避ける。 <ol><li> 4μMのFluo-4ローディング溶液を準備します。 <ol><li> 4 mMのフルオ-4株式の1.5μlのアリコートに1.5ミリリットルのメディアとの250mMプロベネシド株式の1.2を添加する。のFluo-4を50μg、AMに、4mMのフルオ-4ストックはプルロニックF-127の11.4液（0.25％クレマホール-ELを補充したDMSO中20％）を添加することにより調製される。 </li></ol></li><li> 37℃の暗黒インキュベーター内で45分間のFluo-4ローディング溶液中でプレップをインキュベートする。 </li><li>インキュベーターから取り出し、メディアで3回準備を洗う。 </li><li>メディアは200μMのプロベネシドを含む、イメージングの前に37℃で15分間インキュベートするための交換媒体。 注：プロベネシドが神経細胞に多剤耐性トランスポーターを阻害する薬剤である。この薬の添加は、染料を押し出すための神経細胞の能力を阻害し、神経ラベリングを強化します。プロベネシドの不在中のCa 2+指示色素のバルクロードは、主にグリア細胞の負荷を生成します。プロベネシドの添加は、ニューロンおよびグリアの応答の可視化を可能にする。 </li><li>準備クレアル修正BSバッファ。 <ol><li>続いてコンポーネントの（mm）を最終濃度があるように修正されたクレブス緩衝液を作る：121のNaCl、5.9のKCl、2.5のCaCl 2、1.2のMgCl 2、1.2のNaH 2 PO 4、10 HEPES、21.2のNaHCO 3、1ピルビン酸及び8個のグルコース（NaOHでpH7.4に調整されたpH）。のCa 2+イメージングおよびホールマウント解剖時の筋肉の収縮を抑制するために3μMニカルジピンおよび1μMスコポラミンを追加します。 </li></ol></li></ol> 3.イメージングと分析注：蛍光光源、顕微鏡、高品質のCCDカメラと適切な取得ソフトウェアで、少なくとも基本的なイメージング·リグを使用してください。光源と特定の用途に応じて他の成分の添加を変える。フィルターホイールおよびシャッターは、従来のキセノンアーク光源を使用しなければならない。しかし、光源及び照明システムは、これらのコンポーネントを必要としないLED。 <ol><li> RECを置き顕微鏡下でチャンバーディング及び多重加熱シリンジリザーバに重力流灌流システムを用いて、37℃でクレブス緩衝液2-3 ml /分の連続的な灌流速度を確立する。真空トラップに接続された入力と吸引ラインの両方に気泡の発生を防止することを確認してください。 </li><li>明視野照明下での焦点に希望叢を持参してください。フォトブリーチングにつながる可能性があり、組織を、overexposingは避けてください。 </li><li>神経節内のFluo-4の負荷を調べ、イメージングのための健全な神経節を選択します。不健康/損傷した神経節は、自己蛍光または点状の形態を示すであろうし、画像化のために使用すべきではありません。 </li><li>神経節を選択すると、カメラへの光路を迂回し、画像取得ソフトウェアを使用してライブ画像を取得する。神経節に焦点が合うと、画像取得速度と露光時間を設定していることを確認してください。 注：画像取得率と時間は研究者が記録したいイベントによって異なります。ほとんどの実験、イメージの場合グリアのCa 2+応答は、神経細胞におけるCa 2+トランジェントとして急速なようではないので、伝統的にグリア細胞のために、0.5〜1 Hzで取得し、神経細胞のために、最大2-10 Hzのしている。 </li><li>実験を開始し、30秒間のベースラインの活動を確立します。 </li><li>このような2〜3ミリリットル/分の速度で重力流灌流システムを使用して受容体アゴニストおよびアンタゴニストのような関心のある予め温め薬を適用する。通常のバッファーの灌流に戻っアゴニスト/アンタゴニストの適用に従って、少なくとも10分の洗浄/回復期間を可能にする。 NOTE：薬物適用時間は、個々の化合物および実験デザインに依存して変化する。一般に、アゴニストの20~30秒のアプリケーションは、ニューロンおよびグリア細胞におけるGタンパク質共役受容体を活性化するのに十分である。しかしながら、（例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体のような）リガンド依存性イオンチャネルはせいぜい5〜10秒の適用時間を必要とする。さらに持続エクスポージャーは、リガンド依存性イオンチャネルが急速にDESEになりますnsitize。アンタゴニストは、受容体経路の完全な遮断を確保するために約3~15分間適用されるべきである。しかし、これはグロス一般化され、研究者は常に彼らの特定のパラダイム内の任意の試験薬を最適化する必要があります。 </li><li>実験の記録とビュータイムラプスムービーを停止します。適当な画像解析ソフトウェアを用いて関心注意深く選択領域（ROIの）。 </li><li>正規化し、その初期ベースライン蛍光値に対してROI蛍光強度を比較するためにソフトウェアを使用してください。正規化された蛍光の変化は、の[Ca 2+] iの変化に正比例する。 <ol><li> ROI - （（F 1 - F 0）/ F 0）F1は、任意の所与の蛍光バックグラウンド、 - ΔF/ F =（F 0）/ F 0（F 1）を使用して、以前に26の記載された方法の変法を使用し点F0、評価精度を向上させるために、ベースラインの蛍光である。この変更を補助筋層間神経叢の根底にある筋層の動きを示す組織調製物における蛍光の変化からノイズを低減する。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

腸神経系（ENS）は、消化管1の壁内に埋め込 ​​まれた2神経節のある叢で構成されています。これらの筋肉内の神経回路は、筋層間神経叢（MP）と粘膜下神経叢（SMP）は、ニューロンと腸溶性グリア（ 図1）2で構成されている。 MPとSMPは、それぞれ、胃腸（GI）などの腸運動として機能し、上皮吸収および分泌、3を制御する。腸溶性グリアは神経節内のニューロンに近接して配置されているが、腸溶性グリアの集団はまた、繊維路と腸壁3,4の余分な神経節部分を相互接続内に存在する。腸グリアは、元々ニューロンにのみ栄養サポートを提供すると考えられていた。しかし、最近の研究では、強くENSは5,6機能するためのニューロングリア相互作用が必須であることを示唆している。例えば、データは、腸グリアは神経活動を7に「聴く」ことを示しているそして、神経回路6,8を変調する酸化ストレス9から腸ニューロンを保護し、損傷10,11に対応して新たな腸ニューロンを生成することができる。この技術審査で提示プロトコルは、その場の細胞内Ca 2+イメージングで使用してニューロンと腸溶性グリア間の複雑な相互作用を検討するためのシンプルかつ堅牢な方法を提供する。 Ca 2+が興奮性細胞に遍在シグナル伝達分子であり、神経系12におけるシナプスシグナル伝達事象において重要な役割を果たしている。ニューロンまたは腸溶性グリアの励起はどちら流入によってカルシウム2+透過チャネルまたはCaを通じて細胞内カルシウムストアから2+放出を細胞質Ca 2+濃度の上昇を誘発する。蛍光色素でニューロンおよびグリアにおけるイメージングのCa 2+トランジェントの機能的な組織とダイナミクスを研究するために設立され、広く使用される技術であるENS 13-17。のCa 2+イメージングは、ICCのペースメーカーネットワーク18および腸平滑筋19,20を通して興奮の広がりを解明するために、完全な消化管組織セグメントを研究する上で重要なツールであることが示されている。これは、生理的パラメータの広いスペクトルを調べるために、研究者を可能にし、それらの空間分布と時間的なダイナミクスの両方に関する情報を提供します。細胞は、効率的に膜透過性蛍光指示薬、最適化された染色プロトコル21を使用して、低侵襲性の方法で染色することができる。これは、生体内 23だけでなく、機能的に保存調剤14-16,22のニューロンの数が多く、腸溶性グリアを監視する機会を提供しています。組織標本をホールマウントバルクは、Ca 2+に結合した場合、その蛍光を増加するようのFluo-4などの高親和性のCa 2+指示薬色素がロードされている。蛍光の変化はCCDカメラおよびアナによって記録されるデジタルで6溶菌。 Ca 2+の出現は、ニューロンとグリア細胞の相互作用、様々な刺激に応答し、リアルタイムで消化プロセスにおけるこれらの細胞型の関与をモニターする機会を提供した。 その場でのCa 2+イメージングは、腸ニューロンとグリアのシグナル伝達機構に大きな洞察をもたらしたし、細胞培養モデル6,24に比べていくつかの明確な利点を有している。まず、 その場での製剤は、ニューロンとグリアのネイティブマトリックス環境を維持し、無傷組織を標的とするためにその接続の大部分を残す。第二に、遺伝学と培養された腸溶性グリアの形態は大きく、生体内 6,24と比較して変化している。第三に、多くのヘテロタイプの相互作用は、初代細胞培養中に失われ、この制限は、細胞 - 細胞相互作用を評価する。培養した細胞は、基本的な特性の調査、彼らのusefulneに適していますが、腸溶性グリアと神経細胞の間の複雑な相互作用を研究するためのssは限られている。シナプス経路は25そのまま残るように、その場でアプローチを使用して調査ニューロン-グリア相互作用は、より生理学的に関連ある。細胞培養のアプローチと比較すると、 その場でのアプローチで体系的にニューロンと腸溶性グリア間の複雑な相互作用を理解するための改善された条件を提供しています。さらに、全体のマウント製剤における神経節のある叢の平面組織は、細胞内Ca 2+トランジェントの蛍光イメージングのための理想的であり、この技術はENSのニューロン-グリア活性を評価するための直接的なアプローチを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="764">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:391px;">Name</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">BubbleStop Syringe Heater&#160;</td>
			<td style="width:245px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10-4-35-G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">CaCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">C3306</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:245px;">Gibco</td>
			<td style="width:128px;">17101-015</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dispase</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">42613-33-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:245px;">Roboz&#160;</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">DMSO</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">D5879</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fixed-stage microscope</td>
			<td style="width:245px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:128px;">BX51WI</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Fluo-4 AM dye</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">F-14201</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Glucose</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">G8270</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Insect pins</td>
			<td style="width:245px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:128px;">Minutien Pins</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Andor iQ3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">KCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">P3911</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">MgCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M9272</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S9888</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S8282</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S6014</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Neo sCMOS camera</td>
			<td style="width:245px;">Andor</td>
			<td style="width:128px;">Neo 5.5 sCMOS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Nicardipine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">N7510</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Perfusion chamber</td>
			<td style="width:245px;">Custom</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:128px;">Model 720</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Pluronic F-127&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:128px;">P3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Probenecid</td>
			<td style="width:245px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:128px;">P36400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Scopolamine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">S1013&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sutter Lambda DG-4</td>
			<td style="width:245px;">Sutter</td>
			<td style="width:128px;">DG-4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Sylgard&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:128px;">184</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:391px;">Temperature Controller</td>
			<td style="width:245px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:128px;">TC-344C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

この技術の適切な使用は、組織標本をマウント全体の研究者は、正確に細胞内Ca 2+の[Ca 2+] iの腸溶性ニューロンにおける過渡現象とにおけるグリアを測定することができます。マウス結腸の筋層間神経節内のグリア細胞におけるアゴニスト誘発のCa 2+応答の代表的な例は、 ビデオ1に示されている。以下の結果は、我々はこの方法を用いて得られてきたいくつかの代表的な結果を示すことを意味する。まず、 図2は 、腸グリアを測定した実験結果を示した[Ca 2+] iのモルモット結腸の縦筋層間筋肉神経叢（LMMP）準備中のATPによる刺激に応答して変化する。具体的には、この図は、分析筋層間神経節および腸神経の位置を示すアスタリスクの概要を含む上記の実験プロトコルを適切に分析するための方法を示している。これらの結果は、私の[Ca 2+] iのモルモット筋層間神経膠での動員に百マイクロモルのATPの最適な用量をllustrate。この応答は、腸のグリア刺激を較正し、刺激をテストするための応答を正規化するために使用することができる。次に、 図3は 、黄色の円の周囲に示され、適切にグリア細胞の周囲の関心領域（ROI）を選択する方法を解明。これらの結果は、基本条件下および薬理学的刺激に応答して所望の蛍光の変化を示す。最後に、 図4は、全体のマウントの準備での[Ca 2+] iの応答のために腸溶性グリアと神経細胞を選択するための空間的な考慮事項を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> ENSの図1.組織。ENSは、2つの主要な神経節のある叢が含まれています。筋層間神経叢はリットルとの間に配置されるongitudinal円形筋肉層。粘膜下神経叢は、粘膜と円形筋層の間に位置している。 ENSはもっぱらニューロンと腸溶性グリアから構成されている。神経線維トラクトは、神経節を接続してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> その場での ATPに対するモルモット結腸の筋層間神経叢に応答図2.腸グリア。 （A）筋層間神経節内のFluo-4蛍光は基本条件下（破線によって概説）。矢印は、100マイクロモル/ LのATP、グリア細胞に刺激を受けると（B）。厚いinterganglionic繊維路を指してではなく、ニューロン、急激に増加するのFluo-4の[Ca 2+]の増加を示す蛍光<sUB&gt;私。最大応答24を誘発1ミリモル/ Lの用量依存的にATPに応答する（C）腸グリア。応答する細胞が小さく、はるかに大きなニューロン（アスタリスクでマーク暗いスペース）を囲むことに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> その場で ATPに結腸の筋層間神経叢の応答図3.マウスS-100-GFP +細胞。（A）S-100-GFP +マウス結腸の筋層間神経節におけるグリア細胞（緑）（破線で概説）。神経節内のグリア細胞の周囲の関心の6つの領域（ROIを）を黄色の円で示されている。矢印は、神経節に通じる太い線維トラクトを示している。アスタリスクdの2腸溶性ニューロンのenoteの場所。100マイクロモル/ LのATPとの刺激の後、基礎条件の下でRhod-2蛍光。（C）を示す（B）と同じ神経節、グリア細胞が増加して応答がの[Ca 2+] iの増加Rhod-で示した2蛍光。（D）-Cに示した各ROIに対応するトレースします。（E）は D 24に示す6 ROIの応答を（平均±SEM）平均した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> 腸溶性ニューロン対グリア通信のその場イメージングでは、図4。 （A）代表的な画像（疑似カラー）のCa 2+イメージング実験ホールマウントから筋層間神経叢の調製は、神経細胞のP2X7受容体アゴニストBzATP（100μM、30秒）でチャレンジした。神経作用薬の前、周囲の腸のグリア細胞、グリアにおける経時的な蛍光の変化（青）の（A &quot;）。（B）分析およびニューロンニューロン（A &#39;）でFLUO4蛍光の増加を引き起こすことに注意してください（赤）通常のバッファ（実線でBzATPへの神経作用薬、BzATP。（C）は、ニューロンとグリア反応の適用後）、バッファにニューロンのP2X7受容体13を増強するために、低カルシウム2+およびMg 2+（破線）を含む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">してくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 中腸溶性グリアでビデオ1アゴニスト誘起のCa 2+応答その場。このビデオは、Ca 2+指示薬色素、フルオ-4を搭載したマウスの遠位結腸から筋層間神経節を示しています。示されたときに、グリア細胞アゴニスト、ADPは、浴に添加される。 ADPはフルオ-4蛍光で一時的な上昇によって観察されるよう腸溶性グリアに細胞内Ca 2+の上昇を誘発する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a>

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In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

腸神経系のその場のCa 2+イメージングに

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.0K ビュー.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

ビデオ: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

神経科学

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...