この作品はアメリカの小児外科協会財団賞（AG）と健康K08DK098271（AG）の国立研究所メートがサポートされていました。

ウィスコンシン大学の動物実験委員会は、すべての手順を承認しました。 ソリューションの調製<ol><li>解剖緩衝液およびリンス液として1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用します。 </li><li>ボトルにスクロースおよび場所の30グラムを計量することにより、30％スクロースを準備します。 1×PBS 99 mlを加え、1mlの10％アジ化ナトリウムを追加します。ショ糖の全てが溶解するまで十分に混合します。 4℃で保存、必要になるまで。 </li><li> 1×PBS、3％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.1％トリトンX-100を混合して溶液を遮断準備。完全に混合し、必要になるまで冷蔵庫で保管してください。 </li><li> 1×PBS中にPFAの適切な量を秤量することによって1×PBS中の8％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製し、それが完全に溶解するまで65℃でインキュベートします。 -20℃の冷凍庫で25ミリリットルの分量を保存が必要になるまで。使用日の1×PBS中の4％PFAに希釈します。 </li></ol> 2.胚とガット解剖イオン<ol><li>制度動物実験委員会によると、タイミング妊娠マウスを安楽死させるし、PBS 1X氷冷を含む60ミリメートルペトリ皿に子宮を転送プロトコルを承認しました。 </li><li>鋭いハサミを使用して、解剖顕微鏡下で、胚を露出させるオープン子宮壁をカット。子宮から胚を除去し、PBS 1X氷冷を含むクリーンな60ミリメートルペトリ皿に置きます。 </li><li>氷冷1×PBS中で断頭により各胚を安楽死させます。あなたは、蛍光タンパク質を含むトランスジェニックマウスを使用している場合は、蛍光照明の下で、正のトランスジェニック胚を識別します。 </li><li>解剖顕微鏡を使用して、各胚から胃腸管を解剖。微細鉗子の使用、左側が上向きにされ、右側には、ペトリ皿の底に反するような胚を方向付けます。内臓を露出させるために胚から上半身の壁を削除します。背側体壁と内臓の間に微細な鉗子を挿入します。クロム胚から内臓を除去するために、はさみ状の切断動作で互いに対して鉗子をOSS。 </li><li>さらに離れて周囲の器官から胃腸管をサブ解剖した後、氷冷1×PBSを含む1.5 mlマイクロチューブに各GI管を配置します。 </li></ol> GI地帯の3固定<ol><li>氷冷1×PBSで各GI管を3回すすぎ、次いで4％PFAと交換してください。 1.5時間室温でロッキングプラットフォーム上で1.5mlの微小管における消化管を修正しました。 RTで消化管を5分間3回すすぎ、その後、ロッキングプラットフォーム上で1時間。この段階で、必要になるまで、0.1％アジ化ナトリウムを含有する1×PBS中30％スクロースに4℃でGIトラクトを格納します。 注：別の方法として、組織の完全性に影響することなく、1年まで、30％スクロース中の胚を格納します。 30％スクロース中のサンプルの保管は、免疫染色のために、またはクライオsectioniのため10月にいずれかのサンプルの後の処理を可能にしますNG。あるいは、以下に詳述免疫染色プロトコルを進めます。 </li></ol> 4.免疫染色プロトコル<ol><li>サンプルは30％スクロース中で保存されている場合は、ロッキングプラットフォーム上で、それらを1×PBSで20分間3回洗浄します。 </li><li> RTで1時間のためのロッキングプラットフォーム上でブロッキング溶液中に消化管を配置します。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、ロッキングプラットフォーム上で4℃でRTまたはO / Nで4時間のいずれかのためのブロッキング溶液中で希釈した一次抗体の適切な量の消化管をインキュベートします。 （患者から得られた血清）ヒト抗胡抗体1000希釈、1：ニワトリ抗緑色蛍光タンパク質（GFP）抗体1000希釈および1：ヤギ抗ChATの抗体の100倍希釈1を使用してください。 注：私たちは、患者から局所的に得られたヒト抗胡抗体を利用したが、抗胡抗体は、例えば、市販されており、マウス抗胡、（1での使用：500希釈）。 </li><li> 1×PBS中の消化管をすすぎます3回5分間、その後、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間。 </li><li> 4℃でのRTまたはO / Nで4時間のいずれかのためのロッキングプラットフォーム上のブロッキング溶液中で1：500に希釈した二次抗体を用いて1×PBSを交換してください。このようなDylight、ロバ抗ニワトリCy2とし、ロバ抗ヤギCy5のようなロバ抗ヒトアミン反応性染料を使用してください。ロバ抗マウスアミン反応性染料405：500希釈のマウス抗胡抗体を用いた場合は、1を使用します。 注：内因性GFPとtdTomato発現および発達年齢とともに増加して免疫染色を明確にする強さ。我々は、一般的に使用される抗体の量を低減し、また、組織の効率的な染色を確実にするために、染色溶液の150μlを、0.2 mlチューブ中に個別に胚勇気を免疫染色します。 </li><li> 1×PBS中の消化管に5分間、3回洗浄し、その後、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間。 </li><li>スライドガラス上にDAPIで蛍光封入剤を数滴を置きます。 GI TRAを浸します蛍光マウンティング培地中にCTと組織の上に直接カバーガラスを追加します。媒体-Gを取り付ける蛍光は半永久的なシールを提供する水溶性の化合物です。 注：このようなベクタシールドなどを使用し、蛍光封入フェージングおよび抗体の光退色防止媒体を装着するベースグリセロールです。これらの製品はいずれも、組織は4℃で長期間保存することを可能にします。 </li><li>共焦点顕微鏡を用いて蛍光体のそれぞれの画像をキャプチャします。 表3に示す蛍光団および使用するフィルタの励起波長を使用してください。 </li><li>画像をキャプチャするために使用される共焦点の種類に応じて、適切なソフトウェアを使用して、コンピュータ支援画像解析を実行します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+determinants+of+the+independence+and+complexity+of+the+enteric+nervous+system.">Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system.</a> Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+enteric+nervous+system+analysis+during+parenteral+nutrition.">Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition.</a> J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).</li><li>Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacral+neural+crest-derived+cells+enter+the+aganglionic+colon+of+Ednrb(-/-)+mice+along+extrinsic+nerve+fibers.">Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers.</a> J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).</li><li>Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neuronal+density+and+neurotransmitter+expression+in+the+ganglionated+region+of+Ednrb+null+mice:+implications+for+Hirschsprung's+disease.">Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease.</a> Neurogastroenterol Motil. , (2013).</li><li>Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuronal+density+contributes+to+the+severity+of+intestinal+inflammation.">Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation.</a> Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).</li><li>Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagy&#225;nszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. 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P., Kimura, H., Tooyama, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoreactivity+for+Choline+Acetyltransferase+of+Peripheral-Type+(pChAT)+in+the+Trigeminal+Ganglion+Neurons+of+the+Non-Human+Primate+Macaca+fascicularis.">Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis.</a> Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).</li><li>Sang, Q., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+chemical+coding+of+cholinergic+neurons+in+the+small+and+large+intestine+of+the+mouse.">The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse.</a> Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).</li><li>Lei, J., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Hand2+in+enteric+neural+precursor+cells+affects+its+functions+in+neurogenesis,+neurotransmitter+specification+and+gangliogenesis,+causing+functional+aganglionosis.">Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis.</a> Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).</li><li>Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+cholinergic+myenteric+neurons+during+enteric+nervous+system+development:+comparison+of+different+ChAT+fluorescent+mouse+reporter+lines.">Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines.</a> Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).</li><li>Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+Hirschsprung's-associated+enterocolitis:+importance+of+histologic+correlates.">The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates.</a> J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).</li><li>Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Children+with+Hirschsprung's+disease+have+an+abnormal+colonic+mucus+defensive+barrier+independent+of+the+bowel+innervation+status.">Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status.</a> J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).</li><li>Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Pten+in+the+mouse+enteric+nervous+system+induces+ganglioneuromatosis+and+mimics+intestinal+pseudoobstruction.">Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction.</a> J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

私たちの研究室等はHSCR腸内の欠陥があっても神経節の小腸5,15,16に、無神経節結腸に限らず、近位に延長されていないことを示しています。これらの変化はENS神経密度と神経伝達物質表現型の変化を含み、HSCRを有する患者において観察された運動障害を説明することができます。私たちは、ENS形成の決定要因を理解するための努力で上記の技術を利用しています。具体的には、これ?...

運動、栄養吸収、およびローカルの血流を制御する機能腸管神経系（ENS）は、生命1に不可欠です。 ENSは、それらはニューロンおよびグリア細胞を含む神経節に分化腸を移動し、コロニー形成、増殖、神経堤細胞（NCC）によって形成されます。ヒルシュスプルング病（HSCR、男性でのオンラインメンデル遺伝）、1 4,000で出生の発生率とmultigeneic先天性障害は、破壊されたENSの形成を研究するためのプロトタイプの病気と考えることができます。 HSCRでは、NCCはに移動し、遠位後腸2の変数の長さを植民地化することができません。また、他の一般的な胃腸（GI）は、肛門直腸奇形、腸atresias、および運動障害などの小児集団における発達障害は、基本的なENS機能の障害と関連しており、おそらく微妙な、過小評価、解剖学的変化とで機能的変化と関連していますENS 3-6。そのため、私たちはENS形成の発達決定要因を理解することを可能にする技術は、病因および小児消化管障害の治療の可能性に光を当てることができます。 移行と植民地化の後、NCCは、それらの神経伝達物質の表現型に特異的なマーカーでニューロンに分化します。コリン作動性ニューロンは、腸溶性ニューロン7の約60％を含み、かつコリンアセチルトランスフェラーゼ（チャット）、興奮性神経伝達物質アセチルコリンのための合成酵素を染色することによって検出することができます。歴史的には、コリン作動性ニューロンを可視化する試みは、中枢神経系に対して向けられた抗体の抗原特異性（CNS）は、末梢神経系（PNS）のChAT 8-10に対してチャット異なるによって混乱しました。しかし、胎盤のChATに対する抗体は、両方の中央と周辺のChAT 11-13を認識し、我々は最近、visuaを可能にする技術が記載されています高感度のENSのコリン作動性ニューロンのlization以前の開発でチャットレポーター線14で達成されたよりも。 ここでは、ニューロンにおけるENSの神経伝達物質の発現を可視化するマウス胚GI管の、固定および免疫染色を解剖するための手法を提示します。これらの研究のために、我々は、 チャット-Creマウスを利用しているR26Rと交配：floxSTOP：チャットのCreを生成するためにtdTomato動物を、R26R：floxSTOP：tdTomatoマウス （原稿全体のChAT-CreをtdTomatoと定義されます）。これらの動物は、その後のChAT発現14を検出する蛍光レポーターの両方を発現するマウスを得るために、ホモ接合のChAT-GFPレポーターマウスと交配させました。これら二つのレポーター動物は、C57BL / 6Jバックグラウンド上にあり、（ジャクソン·ラボラトリーズ、バーハーバー、ME）は、市販されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-18 stereoscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-18 stereoscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, AL</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining to visualize murine enteric nervous system development

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

我々は以前のChAT発現14を検出GFPおよびtdTomato蛍光レポーターの両方を発現するマウスの生成を記載しています。簡単に説明すると、 チャットCreマウスは、R26Rと交配させた：floxSTOP：チャットのCreを生成するためにtdTomato動物; R26R：floxSTOP：（チャット-CreをtdTomatoと呼ばれる）tdTomatoマウスを。これらの動物は、その後、ホモ接合のChAT-GFPレ...

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Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

マウス腸神経系の開発を可視化するために免疫染色

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must ...

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11.3K ビュー.  University of Wisconsin School of Medicine and Public Health. The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.