研究はWellcome Trustと髄英国で賄われた。 HBMECの細胞株は、博士KS金によって提供されていました。共焦点イメージングと電子顕微鏡は、ウォルフソンのバイオイメージング施設、ブリストル大学で実施された。我々はまた彼らの支援やアドバイスのために氏アランラード、博士マークジェプソン（ブリストル大学）、そしてアランティリー（パーキンエルマー）を感謝したいと思います。

1。免疫蛍光プロトコル種まき、感染＆免疫染色次の手順では、適切な安全レベルの組織培養と微生物学的研究施設が必要です。 1日目感染の標的細胞のA.の準備<ol><li> 12ウェルプレート（3.8 cm 2の成長分野/ウェル）に配置されたカバーガラス（直径16mm）の50％コンフルエントのSeed HBMECs（〜1.5 × 10 4細胞/ cm 2）。 増殖培地：15％熱不活化（56℃、30分）FBS、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100 U / mLのペニシリン/ストレプトマイシン、1％（v / v）のMEM非必須アミノ酸を添加したRPMI 1640酸溶液を、1％MEMビタミンソリューション。 </li><li> 37℃一晩培養（O / N）℃、5％CO 2インキュベーター内でC、。 </li></ol> B.細菌培養<ol><li>興味のひずみを育てる37、10％加熱ウマ血液を補充、必要な培地の例：ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天プレート上でO / N（16-18 H）° C、5％CO 2雰囲気4インチ </li></ol> 2日目細菌（ 髄膜炎菌 ）懸濁液のA.の準備<ol><li> 10μLの文化のループを使用して、2mLのPBSB（カルシウムとマグネシウムを含むPBS）で一晩細菌培養の懸濁液を作る。 </li><li>大規模な細菌の凝集体は、室温（RT）で5分間放置するサスペンションを残すことによって解決することができます。 </li><li>ペレットを乱すことなく、滅菌チューブにサスペンションの上部を1 mL（株接種を）転送する。 </li><li>株式の接種で細菌数を推定するために、0.1M NaOHに1％SDSの1mLのボリュームを含むチューブにアリコート（20〜50μL）を追加し、可溶化するために静かに混ぜる。 </li><li> 260nmの（A260）の吸光度を決定することにより、ソリューションの核酸の含有量を測定します。私たちの手で、1 × 10 8コロニー形成単位に対応する/ mlの（CFU / mL）のA260。これは、PBSBの株式の接種の希釈系列を準備する寒天プレート上にプレーティングし、O / Nインキュベーション後にコロニーを計数することによって確認することができます。 </li><li>感染の媒体中で株式の接種のアリコートを希釈する[（2％を添加したM199 decomplemented（56℃、30分）正常ヒト血清（NHS）]標的細胞の感染に必要な細菌密度を得るために。 <ol><li>当研究室では、標的細胞当たり200〜300細菌の感染率は、日常的に使用されます。 </li></ol></li></ol> B.細胞培養の感染<ol><li>抗生物質の痕跡を削除するには、ハンクの培地で培養した標的細胞で3回カバースリップを洗ってください。 </li><li> 5％CO 2で、37℃3時間〜8時間のため、新たに調製した細菌懸濁液（上記）° Cで細胞を感染させる。 </li><li>感染期間の終了時に、PBSで細胞を3回洗浄し、4℃、RTまたはO / Nで30〜45分間、2％パラホルムアルデヒド500μL（PFA）で修正℃の<ol><li>上記の濃度と同時にパラホルムアルデヒド固定は、細菌や細胞形態の保存に適していることが判明した。 </li></ol></li><li>パラホルムアルデヒドを洗浄した後、0.1％で10分間PBSで希釈したトリトンX - 100をインキュベートすることにより、パラホルムアルデヒド固定した細胞をpermeabilise。 </li><li>サンプルをPBSで3回洗浄する。 </li><li>免疫染色に進むか、代わりに、4℃で1％BSA / PBST O / Nの500μLのサンプルを残す℃に</li></ol> 3日目免疫染色細胞内細菌の染色とα-アクチニンは、以下のように適切な一次および二次抗体の使用により、順次または同時に実行することができます。すべての手続きは、12ウェルプレートで行うことができる。 <ol><li> RTで30〜60分間、3％BSA / PBST（PBS、0.05％トリトンX - 100を含む）の500μLとpermeabilised細胞を含むカバースリップをブロック</li><li> PBSで洗浄後、12ウェルプレートに新しいドライウェルに各カバースリップを転送する。 </li><li>細菌とα-アクチニンに対する一次抗体を追加し、カバースリップの表面を覆うように慎重に追加した場合にカバースリップ当たりの抗体の80〜100μLで十分です。室温で1時間インキュベートする。 <ol><li>我々は、同時にα-アクチニン（アブカム）に対する髄膜炎菌 （実験室で育てられた）およびマウスモノクローナル抗体（mAb）に対するウサギポリクローナル抗血清を使用。いくつかの実験で、抗α-アクチニンの代わりに、アクチンやビメンチンに対するモノクローナル抗体（Sigma社）を使用した。 </li></ol></li><li>インキュベーションの終わりに、ウェルにPBS 200μLを追加し、500μLのPBSを含む新しいウェルのカバースリップと場所を持ち上げます。 </li><li> 5分後、ピペッティングによりPBSを除去し、新鮮なPBSを加える。二回繰り返します。にカバースリップを転送するよく新しい乾いた。 </li><li>暗闇の中で1時間、室温でインキュベートする、1％BSA / PBSTで希釈した異なる蛍光色素に結合した適切な二次抗体を追加。 <ol><li>細菌検出のために、我々はTRITCに結合した抗ウサギIgを使用し、α-アクチニンと他の細胞骨格タンパク質の検出のために、我々はに結合抗マウスIgを使用するのどちらかFITC -（シグマ）又はAlexa Fluor 488 - （Invitrogen社）。 </li></ol></li><li>インキュベーションの終わりには、手順4と5のように洗ってください。 </li><li>暗所で室温で5分間0.6μgの/ PBS中DAPI（DNA染色）で染色されるカウンタ。 </li><li> PBSでリンス。 </li><li>マウンティング培地のドロップとスライド（E、G. MowiolまたはVectashield）上にマウントカバースリップ（細胞が下向きに） </li><li> 4℃暗所で保管℃に</li><li>サンプルは、顕微鏡下で観察するための準備が整いました。 </li></ol> 2。共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM） 観察し、細胞内細菌や細胞骨格要素の画像をキャプチャするために、我々は、ライカDM I6000倒立落射蛍光顕微鏡に取り付けられたライカSP5 - AOBS共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いてimmunolabelledサンプルやキャプチャした画像を使用。すべての画像は、ライカのソフトウェアとの63x NA 1.4油浸対物レンズとプロセスを用いて収集した。 CLSMの手順： <ol><li> CLSMの手順を開始するには、客観的に液浸オイルのドロップを追加し、顕微鏡のステージ上の標本スライドを、カバースリップ面を下に、置きます。 </li><li>ビジュアルモードに顕微鏡をセットし、顕微鏡の接眼を使って関心の領域を見つける。 </li><li>ライカのソフトウェアを使用して、XYZの取得モードを選択します。 </li><li> 512 × 512形式（フレームサイズ）を選択します。 colocalisation研究のための、より高い分解能、より正確なイメージを、念頭に置いて顕微鏡の解像限界を保つ。その後、スキャン速度を増加させる双方向Xのモードを、選択して、光退色を減らすのに役立ちます。 </li><li>シーケンシャルスキャン設定を設定します。 &quot;SEQ&quot;機能をクリックし、スキャンモードのいずれかを選択してください。私たちは、モード&quot;行の間に&quot;使用してください。 </li><li> DAPI（青）、TRITC用のAlexa Fluor ® 488（緑色）と561 nmの（赤）のための488 nmのための405 nmの場合：[レーザーは、二次抗体に結合した蛍光色素に応じてビーム。光電子増倍管（PMT）はそれぞれ1,2、および3は、活性化する。正しい発光波長を検出するPMT設定を調整します。 </li><li> Z -スタックまたは一連の上部（&quot;開始&quot;）とボトム（&quot;最後の&quot;）を設定します。次に、必要な&quot;Z -ステップサイズ&quot;を設定します。 <ol><li> 髄膜炎菌は、双球菌（図1G）であり、各球菌が0.5μmのおおよその直径を有しているため、0.20μmのZ -ステップサイズは少なくとも二回各球菌をスキャンの確率を高めるために選ばれました。 0.2μmの - それは、0.1の最適な解決のためのステップサイズの範囲内である。 </li></ol></li><li>信号対雑音比を向上させるために3行の平均を選択することにより、最終的なスキャンパラメータを設定します。 </li><li> &quot;スタート&quot;をクリックすることで、ダブルまたはトリプル染色像は異なる発色団間のクロストークを除去するために、異なる波長で順次走査することによって得られる。 </li><li> two蛍光色素のcolocalisationの指標については、単一のイメージに選択されたチャネルをマージする&quot;オーバーレイ&quot;機能を選択し、たとえば、アレクサ488（緑）とTRITC（赤）蛍光色素の両方がcolocalise時、黄色の色はオーバーレイ画像に表示されます。 。 </li><li> Z -スタックまたは可能colocalisationを可視化するために必要な2次元画像の構築のための&quot;最大値投影&quot;機能を使用してシリーズをコンパイルします。 colocalisationのより詳細な分析は、それぞれの光学部の解析によって得ることができます。 </li><li> Z -スタックまたはシリーズを取得した後、様々な要素の細胞内局在（図1E）の可視化のための直交のイメージを取得するには、データを処理する。 </li></ol> 3。 Colocalisationの定量化共焦点走査型顕微鏡の画像の統計的な分析は、Volocityソフトウェア（即興、パーキンエルマー）で実行されます。このソフトウェアは、マンダースら （1993）5で説明したようにcolocalisationの分析用に特別に設計されたツールを提供しています。デジタル蛍光イメージングのコンテキストでColocalisationは、同じボクセル（ピクセルボリューム）各チャンネル内の位置での信号の検出として記述することができます。つのチャネルは、同じサンプルエリア（Volocityのユーザーガイド）から採取した二つの異なる蛍光色素の画像で構成されています。統計解析は以下に説明する定量Colocalisation分析を使用してVolocityソフトウェア（即興、パーキンエルマー）で実行されます。 定量的なColocalisation分析<ol><li> Volocityソフトウェアを使用して、CLSM画像とライブラリを作成します。 </li><li>上部のバーにある画像から&quot;拡張フォーカス&quot;を選択します。このツールは、分析する2D画像でのz -スタックをコンパイルします。。 </li><li> &quot;局在&quot;ツールを選択します。分析される2つのチャネルは、同じ色深度を持つ必要があります。 </li><li>それが定量化される予定であることがエリアを選択してください。どんなバックグラウンドを除去するしきい値を設定します。 </li><li> &quot;共局在を生成する&quot;を選択してcolocalisationの出力を作成します。 Colocalisation統計は、以前に選択された関心領域に対して生成されます。 </li><li>マンダース&quot;係数R（係数をオーバーラップ）と私（colocalisation係数）を選択します。 <ol><li>マンダース&quot;の係数は、それらが全体のピクセルの輝度に対して正規化されているとして、染色の強さに敏感ではなく、したがって、それらは、1つの抗原の染色は他よりも強いときに使用することができる。 </li><li>係数をオーバーラップRは、マンダース5,6によるとcolocalisationの真の程度を表し、ピクセルの合計数と比較してcolocalise画素数、すなわち。 </li><li>一方、colocalisation係数は、私の、量の少ない部分（この場合の細菌で、赤）へ、より豊かな部分（この場合はα-アクチニン、緑）の蛍光の寄与を説明し、赤のピクセルの数、すなわちそれは赤のピクセルの合計数と比較して緑のピクセルと重なる。 </li><li>マンダース&quot;の係数は1が高いcolocalisation、0がなしていると、1と0の間の範囲、それらは簡単に解釈するためのパーセンテージとして表すことができます。 </li></ol></li><li>データのプレゼンテーションのためのExcel文書への輸出統計値​​。 </li></ol> 4。代表的な結果 OPC発現髄膜炎菌とα-アクチニンの細胞内局在としてα-アクチニンと（図示せず）3時間の感染実験ではそれほど頻繁であると思われるナノメートルの指示colocalisation上記の3と8時間でのNMを感染させたヒト脳微小血管内皮細胞の共焦点イメージング8時間感染させた培養液と比較して（図1 AF）。 OPC発現髄膜炎菌によるα-アクチニンの実証colocalisationは&gt; 5の反復実験で毎回観察された。上記のようないくつかの共焦点画像を用いたcolocalisationの統計解析を行った。全体的に、HBMECにOPC発現髄膜炎を、緑（α-アクチニン）と赤（ナノメートル）のピクセルの&gt; 25％のオーバーラップが（図2B、係数Rをオーバーラップ）を得たに感染。ビメンチンは稀だと内部化された細菌とアクチンまたはビメンチンのどちらかのラベルが実行されたα-アクチニン、実験とは対照的に、時折colocalisationは、アクチンとが、その観察された（Figure. 2B）。 データも考慮に入れ、各部分の相対量をとる係数マイを、使用して分析した。私はより多くの豊富な信号（この場合は緑、α-アクチニンの）量の少ない信号（この場合は赤、細菌の）が発生するたびに発生頻度の尺度です。この措置は、内部化髄膜炎菌（図2AおよびC）の近傍におけるα-アクチニンの発生の顕著なレベルを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 Nの細胞内相互作用を評価するために共焦点レーザー走査顕微鏡α-アクチニンと髄膜炎菌 。AH。カバースリップ上に成長したコンフルエント内皮単層OPC発現（AF）Nで感染させた髄膜炎菌 。 8時間後、非付着細菌は、細胞はパラホルムアルデヒドで固定し、0.1％トリトンX - 100でpermeabilised、オフ洗浄した。上述のように続いて、細菌とα-アクチニンは（;細菌、赤色のα-アクチニン、緑）に染色した。 AC。 Nmは（A）またはα-アクチニン（B）の位置のXYの画像を示す一つのフィールド。 （C）のオーバーレイイメージは黄色、オレンジ色がcolocalisationを示唆して表示されるいくつかの領域を示している。の矢印（A）と（B）α-アクチニンの蓄積度が高いが、細菌の周囲に発生しているように見える領域を示しています。 セルの底部にある細胞内細菌の周りcolocalisationを示す感染したHBMEC単分子層のD.光学解剖。 再び、このcolocalisationはα-アクチニンの偶発的な近さによるものではない、この地域におけるα-アクチニンの一般的な汚れとして低いです。 上記のように処理感染したHBMEC単分子膜のEとFには、三次元画像。頂端表面の斜視図（E）は、内皮細胞（黄色の矢印）の基底面に向かって位置するいくつかの細菌に対し、付着細菌染色した赤を（赤い矢印）を示す色ではっきりと黄色/オレンジ色です。基底場所がより明確に（F）これは、エンドオンXZ断面であるに見ることができます。 G. N.のネガティブ染色電子顕微鏡像そのを示す髄膜炎から優勢双球菌の。各球菌は、直径約0.5μmである。 <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 HBMEC細胞におけるα-アクチニン、アクチンとビメンチンの局在と分布。 上記の凡例に示すが、α-アクチニンに加えて、いくつかのカバーグラスはα-アクチニンの場合と同様の手順により、アクチンやビメンチンの検出に使用されたとしてHBMECのA.感染した単層を処理した。上記のように、α-アクチニン、いくつかの内部化細菌（白矢印）周辺に集中。ビメンチン、アクチンは、かなりのレベルまで細菌をcolocaliseていませんでした。バーは20μmを表す。 係数Rと私のためにB.＆C.値は、上述したようにVolocityソフトウェアを使用して、つ以上の実験から得られた。

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	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

内部化の結合の可能性OPC発現α-アクチニンにナイセリア髄膜炎は、細菌のcolocalisationと3と8時間の潜伏期間の後、感染細胞の細胞骨格蛋白質の検査でHBMECを用いて検討した。共焦点顕微鏡により、α-アクチニンと髄膜炎菌のcolocalisationを実証することができます。細菌を3時間で内在化されたが、特に、、この時点でα-アクチニンと少しcolocalisationなかった。細胞骨格タンパク質と細菌の関連が8時間の感染期間の後に細胞内の居住のより長い期間を必要とするように登場し、細菌のかなりの数には密接に関連して明らかにα-アクチニンを持っていた。 α-アクチニンは多機能タンパク質であり、細胞骨格要素を持つ細菌の相互作用は、現在の研究の対象となる標的細胞の機能に重要な影響を与える可能性があります。 上記のようcolocalisationの定量化は、細心の試料の準備が必要です。特に注意が期間と抗体希釈液をブロックし、試料の固定に与えられるべきである。対雑音比最高の信号の場合は、それぞれプライマリとセカンダリの抗体は、最適な濃度を決定するために予備実験で滴定する必要があります。我々の経験では、封入剤のMowiolは、より良いイメージを作り出した。

1。共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）： ライカSP5共焦点イメージングシステム：このシステムは、AOTF（音響光学チューナブルフィルター）とAOBS（音響光学ビームスプリッタ）の組み合わせを使用することにより、特定の波長で励起を簡素化します。 2 - ソフトウェア： ライカ共焦点ソフトウェアLCS、ライカマイクロシステムズ、ドイツ。 Volocity 5、即興、パーキンエルマー、米国。

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

髄膜炎菌 （ナノメートル、髄膜炎菌）のOPCの蛋白質はアドヘシンとヒト上皮および内皮細胞のための効果的なインベイシンとして作用することができる表面発現に不可欠外膜タンパク質、です。我々は、OPC、そのようなビトロネクチンのようなインテグリンのリガンドへの最初のバインドにOPCを必要とするプロセスのための主要な受容体として、これらの細胞に発現受容体1を介して内皮細胞表面にあるインテグリンを同定した。このプロセスは、内皮細胞の細菌の侵入を2につながる。最近では、我々はヒトの細胞3の全細胞溶解物に見られる100kDaタンパク質とOPCとの相互作用を観察した。宿主細胞のタンパク質は電気泳動によって分離し、ニトロセルロースにブロットOPC発現ナノメートルを重ねていたとき私たちは、最初にこの相互作用を観察した。相互作用は直接的であり、中間分子を伴うものではなかった。質量分析法により、我々はα-アクチニンなどの蛋白質のアイデンティティを確立した。ない面が発現していないとして、α-アクチニンは調べた8枚のセルラインのいずれかに発見され、標的細胞への細菌侵入に対する血中鉛の存在下で内皮細胞とOPCの相互作用として、我々は細胞内で相互作用する2つのタンパク質の可能性を検討した。このため、培養ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMECsは）長期間と内部化された細菌とα-アクチニンの位置については、OPC発現Nmで感染させた共焦点顕微鏡で調べた。私たちは、細菌の内部化の8時間後にはかなりいた細胞骨格タンパク質、とNmのcolocalisationにおける時間依存増加を観察した。さらに、定量的なイメージングソフトウェアを使用することにより、α-アクチニンと他の細胞骨格タンパク質とナノメートルのcolocalisationの相対的な尺度を得ることができました。手順を実行すると、ヒト上皮細胞にも適用可能であるが、ここでは、ヒト内皮細胞への細菌侵入後の細胞内タンパク質と細菌のcolocalisationの可視化と定量化のためのプロトコルを提示する。

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

髄膜炎菌 （ナノメートル）、グラム陰性ヒト特異的な呼吸器病原体は、ヒトα-アクチニンに結合することができる。ここでは、人間の脳の微小血管内皮細胞（HBMECs）への細菌侵入後のα-アクチニン細胞と細菌のcolocalisationの可視化のためのプロトコルを提示する。

の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌</em共焦点イメージングによるα-アクチニン>と人間

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

18.0K ビュー.  University of Bristol, UK. 髄膜炎菌 （ナノメートル）、グラム陰性ヒト特異的な呼吸器病原体は、ヒトα-アクチニンに結合することができる。ここでは、人間の脳の微小血管内皮細胞（HBMECs）への細菌侵入後のα-アクチニン細胞と細菌のcolocalisationの可視化のためのプロトコルを提示する。

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

免疫・感染学

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

細菌性病原体による細胞の感染を調査するためにイメージングInlC分泌<em&gt;リステリア菌</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

共焦点レーザー Endomicroscopy Ex Vivoひと肺組織の新規細菌固有の光学検査プローブします。

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivoひと免疫不全ウイルス 1 における抗癌剤感受性との人間のリンパ組織と女性の性器粘膜の感染症

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌と人間